血管生成素樣蛋白2與高脂血癥性急性胰腺炎的相關(guān)性研究

夏亞蘭，王民開

（1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，貴州 都勻 558000）

高脂血癥是急性胰腺炎發(fā)病的重要原因之一，其病因復(fù)雜，可能與高脂血癥直接損傷、微循環(huán)障礙、胰蛋白酶原激活等有關(guān)[1-2]。血管生成素樣蛋白2（Angptl2）主要是在鼠肝臟特異性表達的分泌型蛋白質(zhì)，參與調(diào)節(jié)脂類代謝及抑制脂蛋白酶的活性，進而升高血漿血脂水平[3]。目前，Angptl2基因高表達可能與冠心病、糖尿病、腎病、腫瘤血管形成等存在一定相關(guān)性，但尚無關(guān)于Angptl2基因與高脂血癥性胰腺炎相關(guān)性的報道[4-5]。本研究通過建立相關(guān)動物模型，探討Angptl2與高脂血癥性急性胰腺炎的相關(guān)性，為該疾病開辟新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

試劑：戊巴比妥鈉（湖北鴻運隆生物科技有限公司）、丙基硫氧嘧啶（上海麥克林生化科技有限公司）、牛磺膽酸鈉（美國Sigma公司）、膽酸鈉及膽固醇（上海寶曼生物科技有限公司）、吐溫-80（天津市福晨化學(xué)試劑廠）、甲醛（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、無水乙醇（上海弗霓生物科技有限公司）、Trizol試劑（Invitrogen公司）、T0901317（上海 selleck chem 公司）、淀粉酶試劑盒（南京建成生物有限公司）、Angptl2試劑盒（美國UCL公司）。

儀器：實時熒光PCR（ABI7300）、熒光倒置顯微鏡成像系統(tǒng)（奧林巴斯公司）、離心機（北京奧德公司）、移液器（德國Eppendorf公司）、低溫冰箱（海爾集團）、恒溫水浴箱（上海精宏公司）。

1.2 實驗動物及分組

選取實驗動物中心提供的180只清潔級SPrague-Dawley（SD）雄性大鼠，體質(zhì)量 160～180 g，平均體質(zhì)量（169.26±0.37）g。采用隨機數(shù)字表法分為正常組（n=30）、高脂血癥組（n=30）、高脂血癥性急性胰腺炎組（n=30）、急性重癥胰腺炎組（n=30）、藥物高脂血癥組（n=30）、藥物高脂血癥性急性胰腺炎組（n=30）。所有大鼠均喂養(yǎng)均衡飼料，每日補充或更換飼料、飲水及墊料等。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 正常組：予以均衡飼料，術(shù)中僅翻動大鼠胰腺及十二指腸。高脂血癥組：予以高脂飼料（77%均衡飼料+20%豬油+3%膽固醇），構(gòu)建高脂血癥模型，術(shù)中僅翻動大鼠胰腺及十二指腸。高脂血癥性急性胰腺炎組：予以高脂飼料，頭皮針逆行穿刺胰膽管注射5%?；悄懰徕c溶液，構(gòu)建高脂血癥性急性胰腺炎模型。急性重癥胰腺炎組：予以均衡飼料，急性重癥胰腺炎模型構(gòu)造與高脂血癥性急性胰腺炎組類似。藥物高脂血癥組及藥物高脂血癥性急性胰腺炎組：相關(guān)模型制備如前所述，采用10 mg/kg肝X受體（LXR）激動劑T0901317灌胃，制備藥物模型[6-7]。所有大鼠均喂養(yǎng)2周。

1.3.2 Angptl2 mRNA及其蛋白檢測 用Trizol試劑提取大鼠肝臟組織總RNA，溶解于無Rnase的水中，取總RNA 2 μg，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。取10 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR反應(yīng)，用ΔΔCt值法，以GAPDH表達為內(nèi)參照，觀察定量Angptl2 mRNA的表達。Angptl2引物序列：上游：5'-CAAGATGATCTGCCTGCTGACT-3'；下游：5'-ATGTCCGTGGAGTGCCTGA-3'；參照GAPDH引物序列上游：5'-GCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'；下游：5'-GGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。模型建立6 h后，大鼠心臟穿刺采血5 mL，離心機離心15 min（3 000 r/min），得血清。采用美國Eh800型BioTek酶標儀測定450 nm處光密度值，然后參考標準曲線查出相對應(yīng)的血清Angptl2水平。

1.3.3 病理切片 用10%福爾馬林常規(guī)固定大鼠胰腺組織，石蠟包埋、切片。采用HE染色胰腺組織，光鏡下觀察胰腺組織情況。采用Grewal法[8]進行胰腺組織病理評分，具體如下：（1）水腫。0分：無水腫；1分：葉間隙輕度增寬；2分：葉間隙重度增寬；3分：腺泡間隙增寬；4分：細胞間隙增寬。（2）壞死。0分：無壞死；1分：壞死面積≤10%；2分：10%＜壞死面積≤20%；3分：20%＜壞死面積≤30%；4分：壞死面積＞30%。（3）炎癥。高倍鏡下，0.1分/個炎性細胞，若炎性細胞數(shù)≥30個，則計4分。（4）出血。0分：無出血；1分：出血。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，采用F檢驗來計算Angptl2 mRNA、蛋白等計量資料平均值的差異程度，采用LSD-t檢驗進行組間比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Angptl2 mRNA及其蛋白表達情況

高脂血癥組及高脂血癥性急性胰腺炎組Angptl2蛋白和Angptl2 mRNA水平均高于正常組及急性重癥胰腺炎組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；藥物高脂血癥組及藥物高脂血癥性急性胰腺炎組Angptl2蛋白、Angptl2 mRNA均高于正常組、高脂血癥組、高脂血癥性急性胰腺炎組、急性重癥胰腺炎組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；藥物高脂血癥組與藥物高脂血癥性急性胰腺炎組Angptl2 mRNA及Angptl2蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表 1。

表1 各組Angptl2 mRNA及其蛋白表達情況（±s）

表1 各組Angptl2 mRNA及其蛋白表達情況（±s）

注：與正常組相比，△P<0.05；與高脂血癥組相比，*P<0.05；與高脂血癥性急性胰腺炎組相比，#P<0.05；與急性重癥胰腺炎組相比，&P<0.05

Angptl2 mRNA Angptl2蛋白（ng/mL）組別正常組高脂血癥組高脂血癥性急性胰腺炎組急性重癥胰腺炎組藥物高脂血癥組藥物高脂血癥性急性胰腺炎組例數(shù)30 30 30 30 30 30△△1.51±0.31 2.08±0.17 2.57±0.29 1.85±0.24 5.62±0.53 5.48±0.57 717.20<0.01△*△*#△*#&△*#&△*△*#△*#&△*#&F P--28.31±12.32 40.15±18.51 49.52±21.37 30.85±14.50 61.85±26.60 60.85±23.57 15.70<0.01

2.2 各組血清總膽固醇、甘油三酯、淀粉酶水平比較

高脂血癥組及高脂血癥性急性胰腺炎組總膽固醇、甘油三酯、淀粉酶水平均高于正常組及急性重癥胰腺炎組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；藥物高脂血癥組及藥物高脂血癥性急性胰腺炎組總膽固醇、甘油三酯水平均高于正常組、高脂血癥組、高脂血癥性急性胰腺炎組、急性重癥胰腺炎組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；藥物高脂血癥組總膽固醇、甘油三酯水平高于藥物高脂血癥性急性胰腺炎組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；藥物高脂血癥組淀粉酶水平低于藥物高脂血癥性急性胰腺炎組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 各組血清總膽固醇、甘油三酯、淀粉酶水平比較（±s）

表2 各組血清總膽固醇、甘油三酯、淀粉酶水平比較（±s）

注：與正常組相比，△P<0.05；與高脂血癥組相比，*P<0.05；與高脂血癥性急性胰腺炎組相比，#P<0.05；與急性重癥胰腺炎組相比，&P<0.05；與藥物高脂血癥組相比，@P<0.05

甘油三酯（mmol/L） 淀粉酶（U/L）總膽固醇（mmol/L）組別正常組高脂血癥組高脂血癥性急性胰腺炎組急性重癥胰腺炎組藥物高脂血癥組藥物高脂血癥性急性胰腺炎組例數(shù)30 30 30 30 30 30△△2.97±1.32 4.87±1.85 6.52±2.70 3.80±1.66 10.34±3.65 9.82±2.73 48.12<0.01△△*△*#△*#&△*#&@△*△*#△*#&△*#&@△*△*#△*#&△*&@F P--0.82±0.13 1.20±0.24 1.38±0.17 1.07±0.15 1.98±0.41 1.79±0.37 81.03<0.01 703.89±113.65 985.72±153.58 3 021.83±1 527.65 813.26±133.07 1 219.92±285.74 2 937.62±1 510.53 43.59<0.01

2.3 各組胰腺組織病理評分比較

高脂血癥性急性胰腺炎組與藥物高脂血癥性急性胰腺炎組水腫、壞死、炎癥、出血評分均高于正常組、高脂血癥組、急性重癥胰腺炎組、藥物高脂血癥組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；高脂血癥性急性胰腺炎組與藥物高脂血癥性急性胰腺炎組水腫、壞死、炎癥、出血評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。高脂血癥性急性胰腺炎組可見炎性細胞浸潤、出血、壞死表現(xiàn)；藥物高脂血癥性急性胰腺炎組較高脂血癥性急性胰腺炎組更為嚴重，見圖1。

3 討論

3.1 高脂血癥性急性胰腺炎發(fā)病原因

高脂血癥是導(dǎo)致急性胰腺炎的主要病因之一，可加重急性重癥胰腺炎病理損害。相關(guān)研究表明，大鼠胰腺灌注不同濃度甘油三酯，其淀粉酶水平均升高，且灌注濃度越高，淀粉酶水平越高[9-10]。本研究通過飼喂高脂飼料及頭皮針逆行穿刺胰膽管注射5%?；悄懰徕c溶液，構(gòu)建高脂血癥性急性胰腺炎模型，發(fā)現(xiàn)其淀粉酶水平高于正常組、高脂血癥組、急性重癥胰腺炎組及藥物高脂血癥組（P＜0.05），且水腫、壞死、炎癥、出血評分也較高，鏡下胰腺組織表現(xiàn)更為嚴重，與國內(nèi)外研究類似?？赡芘c胰脂肪酶將甘油三酯水解為游離的脂肪酸而氧化損傷腺泡細胞，促使胰酶釋放，導(dǎo)致胰腺損害有關(guān)[11]。此外，游離脂肪酸分解產(chǎn)物可激活胰蛋白酶原，促使腺泡分解，更加加重胰腺損傷[12]。目前，關(guān)于高脂血癥性急性胰腺炎的研究主要停留在臨床研究，對于其發(fā)病相關(guān)基因研究報道甚少。

表3 各組胰腺組織病理評分比較（±s，分）

表3 各組胰腺組織病理評分比較（±s，分）

注：與正常組相比，△P<0.05；與高脂血癥組相比，*P<0.05；與高脂血癥性急性胰腺炎組相比，#P<0.05；與急性重癥胰腺炎組相比，&P<0.05；與藥物高脂血癥組相比，@P<0.05

1.00±0.00 0.65±0.28 0 1.00±0.00 574.94<0.01組別正常組高脂血癥組高脂血癥性急性胰腺炎組急性重癥胰腺炎組藥物高脂血癥組藥物高脂血癥性急性胰腺炎組壞死出血例數(shù)30 30 30 30 30 30△水腫0.41±0.52 0.85±0.44 3.83±0.47 2.81±0.83 0.95±0.42 3.38±1.15 136.02<0.01 0 0△0 0△*△*#△*#&△*&@△*△*#3.65±0.53 2.27±0.42 0 3.77±1.30 285.66<0.01△*△*#△*&@△*△*#△*#&△*&@△*&@F P--炎癥0.21±0.25 0.51±0.37 3.47±0.81 2.45±0.92 0.65±0.32 3.44±0.83 164.82<0.01

圖1 胰腺組織HE染色（×400）

3.2 Angptl2升高高脂血癥性急性胰腺炎血脂水平

Angptl2可調(diào)節(jié)體內(nèi)脂代謝及促進血管生成，可升高大鼠血脂水平及抑制脂肪酶活性[13]。相關(guān)研究表明，Angptl2高表達與冠心病、冠狀動脈粥樣硬化、腎病、糖尿病等存在一定相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥性急性胰腺炎組Angptl2蛋白及Angptl2 mRNA水平均高于正常組、高脂血癥組、急性重癥胰腺炎組（P＜0.05），血清總膽固醇及甘油三酯水平均較高，表明Angptl2可升高高脂血癥性急性胰腺炎的血脂水平，可能與其具有一定相關(guān)性。

3.3 LXR激動劑T0901317上調(diào)Angptl2水平

本研究進一步每天用10 mg/kg LXR激動劑T0901317給大鼠灌胃，一周后構(gòu)建藥物高脂血癥模型及藥物高脂血癥性急性胰腺炎模型，發(fā)現(xiàn)兩種模型的Angptl2蛋白、Angptl2 mRNA、總膽固醇、甘油三酯水平均高于其他4組（P＜0.05），可能是LXR激動劑T0901317可聚集大鼠肝臟及血漿中的甘油三酯，加速膽固醇的逆轉(zhuǎn)運，誘導(dǎo)Angptl2 mRNA表達，導(dǎo)致上述指標水平升高[14-15]。另外，藥物高脂血癥性急性胰腺炎組與高脂血癥性急性胰腺炎組淀粉酶水平及胰腺組織病理評分無明顯差異（P＞0.05），但鏡下發(fā)現(xiàn)藥物高脂血癥性急性胰腺炎組炎性細胞浸潤、出血、壞死表現(xiàn)更為嚴重，表明Angptl2可能參與了高脂血癥性急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展，且LXR激動劑T0901317可能上調(diào)大鼠Angptl2水平，導(dǎo)致胰腺組織損害更加明顯。

綜上所述，Angptl2與高脂血癥性急性胰腺炎存在一定的相關(guān)性，LXR激動劑T0901317可上調(diào)高脂血癥性急性胰腺炎大鼠Angptl2水平，加劇胰腺損傷。