牦牛HDAC8基因特征及其在組織和卵母細(xì)胞成熟過程中的表達(dá)分析

秦文昌,殷 實(shí),李澤沛,王 斌,楊柳青,周婧雯,李 鍵

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)作為青藏高原及毗鄰地區(qū)特有的牛種資源,能為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┐罅康纳a(chǎn)生活資料。但是,牦牛存在性成熟延遲、低繁殖力及生產(chǎn)性能低下等缺陷[1],制約著牦牛體細(xì)胞克隆與體外受精等繁殖輔助技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用,進(jìn)而影響牦牛的種群繁殖及經(jīng)濟(jì)效益。因此,針對牦牛的生殖細(xì)胞特征進(jìn)行研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

組蛋白乙酰化是由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferase,HATs)與組蛋白去乙?；?Histone deacetylase,HDAC)共同調(diào)節(jié)的可逆過程[2]。乙酰化修飾多發(fā)生于H3組蛋白和H4組蛋白的6個賴氨酸位點(diǎn)上(H3K9、H3K14、H4K5、H4K8、H4K12和H4K16)。HDACs是一類平衡染色質(zhì)重塑中HAT乙?；顒拥拿割?在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用[3]。迄今,有4 類HDAC已在哺乳動物中被確認(rèn),Ⅰ類(HDAC1～3和HDAC8)；Ⅱ類(HDAC4～6、HDAC7A、HDAC9 及HDAC1); Ⅲ類(SIRT1～7)和IV類(HDAC11)[4]。通過HDACs的作用可以將組蛋白賴氨酸上乙?；摩?氨基的乙?；コ?降低體內(nèi)乙?；?使DNA與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合受阻,轉(zhuǎn)錄過程受到抑制[5]。

組蛋白去乙酰化參與卵母細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變, 在卵母細(xì)胞的生長發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7],是卵母細(xì)胞成熟及染色體正確分離的關(guān)鍵。卵母細(xì)胞中HDAC1和HDAC2的缺乏導(dǎo)致組蛋白乙?；潭仍黾忧衣雅莅l(fā)育停滯于次級卵泡階段[8]。組蛋白去乙?；笇ωi和小鼠卵母細(xì)胞成熟過程的正常進(jìn)行是必需的,在小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞中發(fā)生組蛋白去乙?；?這種去乙?；l(fā)生于核心組蛋白特定的賴氨酸位點(diǎn),組蛋白H3K9ac、H3K18ac、H4K5ac、H4K12ac及H4K16ac的水平隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育顯著上調(diào)[9-10]。此外,在減數(shù)分裂過程中,抑制HDAC導(dǎo)致卵子的非整倍性及后續(xù)胚胎的死亡[11]。表明卵母細(xì)胞成熟過程中,正常染色體功能的維持需要HDAC的參與。在GV期卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中添加HDAC抑制劑TSA,卵母細(xì)胞的成熟被阻止在減數(shù)分裂前期,表明卵母細(xì)胞的成熟及后續(xù)胚胎的發(fā)育與組蛋白乙酰化修飾表達(dá)模式的改變密切相關(guān)[12]。

組蛋白去乙酰化酶8(Histone deacetylases 8,HDAC8)是Ⅰ類鋅離子依賴性組蛋白去乙?；?存在H4組蛋白第16位賴氨酸殘基的乙?；揎?Histone H4 Lys16 acetylation,H4K16ac)和H4組蛋白第20位賴氨酸殘基的乙?；揎?Histone H4 Lys20 acetylation,H4K20ac)[13-14]。對HDAC8的研究表明,其廣泛參與各類生物學(xué)過程,在低等動物如血吸蟲中抑制HDAC8可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的血吸蟲幼蟲死亡,并使成蟲的生殖器官發(fā)生改變,導(dǎo)致蟲對分離和排卵停止[15]。HDAC8還可以調(diào)控多種細(xì)胞進(jìn)程,如姐妹染色單體分離、維持微管完整性和肌肉收縮等[16]。此外,Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn),HDAC8廣泛分布于小鼠GV期卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。生發(fā)泡破裂(Germinal vesicle breakdown,GVBD)后,HDAC8開始積聚于染色體周圍,在MⅠ和MⅡ期定位于紡錘體極,并積極參與小鼠卵母細(xì)胞中紡錘體組裝和染色體排列的調(diào)控,維持減數(shù)分裂過程中卵母細(xì)胞染色體的整倍性。利用siRNA干擾HDAC8表達(dá)后,導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞紡錘體嚴(yán)重缺陷、卵母細(xì)胞紡錘體向皮質(zhì)遷移、染色體排列異常、卵母細(xì)胞MⅠ期阻滯及第一極體排出率下降。表明HDAC8參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中紡錘體組裝和染色體排列等過程,進(jìn)而影響小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的進(jìn)程。

目前,關(guān)于HDAC8的相關(guān)研究主要集中在小鼠等模式動物上,而在牦牛組織器官及卵母細(xì)胞成熟過程中的作用研究尚未見報(bào)道。因此,本研究將牦牛作為試驗(yàn)對象,通過RT-PCR方法克隆牦牛HDAC8基因序列,并通過生物信息學(xué)方法分析其序列及蛋白理化性質(zhì),qRT-PCR技術(shù)檢測HDAC8在牦牛組織及卵母細(xì)胞成熟過程中的表達(dá)規(guī)律,為進(jìn)一步揭示該基因在牦牛生殖繁育中的調(diào)控作用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 牦牛組織樣本的采集 牦牛屠宰后立即采集其肺臟、肝臟、肌肉、卵巢、脾臟、乳腺、睪丸、腎臟、胃和心臟組織,編號后置于液氮內(nèi)保存?zhèn)溆?組織樣本均采自成都青白江區(qū)屠宰場。

1.1.2 主要試劑及器材 PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、DNA聚合酶Premix TaqTM、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD-19T Vector(TaKaRa,大連)；TRIzol Reagent(Invitrogen,美國),DNA膠回收試劑盒(Axygen,北京)；Gibco M199培養(yǎng)基(Gibco,澳洲)；卵母細(xì)胞成熟液(M199+10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)+0.01 μg/L促卵泡生長激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)+0.01 μg/L促黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)+0.01 μg/L雌二醇(Estradiol,E2)+0.02 ng/L表皮細(xì)胞生長因子(Epidermal growth factor,EGF))；熒光定量PCR儀(Biodine rad,美國),細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo,美國)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牦牛卵丘-卵母細(xì)胞 (Cumulus-oocyte compplex,COCs)的成熟培養(yǎng) 采集的牦牛卵巢用37 ℃無菌生理鹽水沖洗3次,使用10 mL注射器抽取卵巢表面直徑在2～8 mm卵泡的卵泡液。抽取的卵泡液置于60 mm培養(yǎng)皿中,并置于體視顯微鏡下挑揀COCs。將挑揀的COCs置于卵母細(xì)胞成熟液中洗3次,然后轉(zhuǎn)移至平衡好的卵母細(xì)胞成熟液中,在飽和濕度,5% CO2,38.5 ℃條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)[18]。對應(yīng)培養(yǎng)時長分別收集GV(0 h)、MⅠ(12 h)和MⅡ期(24 h)的COCs,經(jīng)0.5%透明質(zhì)酸酶去除卵丘細(xì)胞,置于去RNA酶的離心管中。

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的合成 按照TRIzol法和Single Cell-to-CtTMKit (Invitrogen,美國) 試劑盒說明書,分別提取牦牛組織和卵母細(xì)胞的總RNA,并使用核酸分析儀測定總RNA的純度和濃度。將OD260/280比值為1.8～2.0的RNA作為模板,依照PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,保存于-20 ℃?zhèn)溆谩U(kuò)增體系:5×PrimeScriptTMBuffer 4 μL,PrimeScriptRTEuzyme Mix I 1 μL,Oligo dT Primer (50 μmol/L) 1 μL,Random 6 mers(100 μmol/L)1 μL,cDNA 1 μL,RNase Free ddH2O補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增條件:15 min(37 ℃),5 s(85 ℃)。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中黃牛(Bostaurus)HDAC8基因(GenBank No.XM_024988193.1)和β-actin基因(GenBank No.AY141970.1)的mRNA序列分別設(shè)計(jì)克隆及qRT-PCR引物,引物設(shè)計(jì)由Primer 5.0軟件進(jìn)行(表1),由南京金斯瑞生物科技公司合成。

表1 引物信息Tab.1 The informations of primers

注:S.正義鏈引物；A.反義鏈引物。

Note:S.Sense primer; A.Antisense primer.

1.2.4 牦牛HDAC8基因的克隆 以牦牛肝臟cDNA為模板,PCR方法擴(kuò)增HDAC8序列。擴(kuò)增體系:cDNA 1 μL,Sense primer(10 μmol/L)和Antisense primer(10 μmol/L)各1 μL,Premix TaqTMDNA聚合酶12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增條件:預(yù)變性4 min(94 ℃)；變性45 s(95 ℃),退火45 s(60 ℃),延伸1 min(72 ℃),35個循環(huán)；延伸10 min(72 ℃)。根據(jù)DNA膠回收試劑盒使用說明純化擴(kuò)增產(chǎn)物,再將其與pMD-19T Vector連接2 h(16 ℃),轉(zhuǎn)化至DH5α后篩選陽性克隆并進(jìn)行菌液PCR鑒定,送交生工測序。

1.2.5 牦牛HDAC8基因序列分析 根據(jù)NCBI中ORF Finder查找牦牛HDAC8序列開放閱讀框；核苷酸及氨基酸序列相似性比對由NCBI中在線程序Blast分析；MEGA 7.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹；通過在線軟件ExPASy ProtParam、TMHMM、SignaIP 4.1 Server 、Targetp、NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0、NetNGlyc 1.0、Hopfield、Swiss-model和STRING 交互式數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測分析HDAC8蛋白的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽、亞細(xì)胞定位、磷酸化位點(diǎn)、O-糖基化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和蛋白相互作用。

1.2.6 牦牛HDAC8基因組織表達(dá)差異分析 qRT-PCR方法檢測HDAC8在牦牛不同組織中的表達(dá)規(guī)律。反應(yīng)體系:cDNA 1 μL,上游引物(10 μmol/L)和下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL,ddH2O 5.5 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性3 min(95 ℃)；變性10 s(95 ℃),退火30 s(60 ℃),40個循環(huán)。以β-actin為參照基因,每個組織樣本設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.7 牦牛HDAC8基因在卵母細(xì)胞成熟過程中的表達(dá)差異 qRT-PCR技術(shù)檢測牦牛GV、MⅠ和MⅡ期卵母細(xì)胞中HDAC8的表達(dá)規(guī)律,反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.2.6。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過2-ΔΔCt法將數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。顯著性分析由SPSS 19.0軟件中單因素方差(ANOVA)進(jìn)行,P<0.05,認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛HDAC8基因的克隆及序列分析

經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn),擴(kuò)增產(chǎn)物為一條與預(yù)期目的產(chǎn)物大小一致的特異片段(圖1)。牦牛HDAC8基因序列為1 109 bp,CDS區(qū)為1 008 bp,編碼氨基酸335個。

利用NCBI中在線程序Blast對克隆獲得的牦牛HDAC8基因序列與黃牛、綿羊、駱駝、豬、白豚、犬、貓、馬、人類及黑猩猩的HDAC8基因序列進(jìn)行比較分析,牦牛HDAC8基因與黃牛、綿羊和駱駝等哺乳動物的序列相似性高達(dá)94%以上(表2),表明該基因在進(jìn)化過程中高度保守。同時利用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹,聚類結(jié)果表明,牦牛與黃牛聚為一類,親緣關(guān)系最近(圖2)。

M．DL2000 DNA Marker；1．HDAC8 PCR擴(kuò)增片段。 M．DL2000 DNA Marker；1．PCR product of HDAC8.

表2 牦牛HDAC8基因與其他物種的相似性比較Tab.2 Identity of yak HDAC8 gene with the corresponding sequences of various species %

圖2 不同物種間HDAC8基因的進(jìn)化關(guān)系分析Fig.2 Evolutionary relationship analysis of HDAC8 gene between different species

2.2 牦牛HDAC8蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測分析

牦牛HDAC8蛋白分子式為C1666H2554N436O490S17,分子質(zhì)量為37.08 ku,原子總數(shù)為5 163,理論等電點(diǎn)(pI)為5.49,不穩(wěn)定指數(shù)為37.04,親水性總平均值為-0.101,脂肪系數(shù)為87.91,屬于脂溶性蛋白。牦牛HDAC8所編碼的335個氨基酸中甘氨酸(Glycine, Gly，9.6%)、亮氨酸(Leucine, Leu，9.0%)、天冬氨酸(Asparagine, Asp，7.5%)、丙氨酸(Alanine, Ala，7.5%)、纈氨酸(Valine, Val，6.9%)和異亮氨酸(Isoleucine, Ile，6.6%)出現(xiàn)的頻率較高。同時帶正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys=29)少于帶負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu=41),預(yù)測該蛋白整體帶負(fù)電荷。親疏水性預(yù)測分析表明,HDAC8蛋白親水性分值在第318處最小,親水指數(shù)為-3.378,第261處最大,親水指數(shù)為1.756,且較大多數(shù)氨基酸殘基具有親水性,預(yù)測該蛋白為親水穩(wěn)定蛋白。

2.3 牦牛HDAC8蛋白結(jié)構(gòu)與功能的預(yù)測分析

預(yù)測分析結(jié)果表明,牦牛HDAC8蛋白無信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域,包含17個絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、15個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)和10個蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)及3個O-糖基化位點(diǎn),無N-糖基化位點(diǎn)。主要在細(xì)胞質(zhì)(52.2%)、細(xì)胞骨架(21.7%)和細(xì)胞核(17.4%)中發(fā)揮生物學(xué)作用。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明,α-螺旋占22.09%,延伸鏈占28.36%,無規(guī)則卷曲占49.55%。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致(圖3)。蛋白相互作用分析發(fā)現(xiàn),HDAC8蛋白可能與染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白3(Structural maintenance of chromosomes protein 3,SMC3)、染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白1A(Structural maintenance of chromosomes protein 1A,SMC1A)、雙鏈斷裂修復(fù)蛋白RAD21樣蛋白1(Double-strand-break repair protein rad21-like protein 1,RAD21)、半翼蛋白(Bwings apart-like protein,WAPAL)、染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白4(Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 4,CHD4)、姐妹染色單體凝聚蛋白PDS5同源物A(Sister chromatid cohesion protein PDS5 homolog A,PDS5A)、姐妹染色單體凝聚蛋白PDS5同源物B(Sister chromatid cohesion protein PDS5 homolog B,PDS5B)、基質(zhì)抗原1(Stromal antigen 1, STAG1)、基質(zhì)抗原2(Stromal antigen 2,STAG2)及核受體輔阻抑物2(Nuclear receptor corepressor 2,NCOR2)等蛋白相互作用(圖4)。

圖3 牦牛HDAC8蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Tertiary structure prediction of HDAC8 protein in yak

2.4 HDAC8在牦牛組織中的表達(dá)模式

通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn),牦牛HDAC8mRNA普遍表達(dá)于牦牛多個組織,高表達(dá)于肝臟組織中,極顯著高于其他組織(P<0.01),肺臟和胃組織中也有較高水平的表達(dá),極顯著高于心臟、脾臟、腎臟、肌肉、乳腺、睪丸和卵巢組織(P<0.01)(圖5)。

2.5 HDAC8在牦牛卵母細(xì)胞成熟過程中的表達(dá)水平分析

本試驗(yàn)依據(jù)牦牛卵母細(xì)胞發(fā)育的特點(diǎn)及西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)選擇GV、MⅠ和MⅡ期卵母細(xì)胞,檢測HDAC8在牦牛卵母細(xì)胞成熟過程中的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明,HDAC8表達(dá)水平隨著卵母細(xì)胞成熟階段的遞增呈上升趨勢,在MⅡ期表達(dá)水平最高(圖6),極顯著高于GV和MⅠ期(P<0.01)。

圖4 HDAC8蛋白與其他蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.4 The interaction network of HDAC8 with other protein

1.肺臟；2.肝臟；3.睪丸；4.肌肉；5.卵巢；6.脾臟；7.乳腺；8.腎臟；9.胃；10.心臟；n=3；內(nèi)參基因.β-actin；大寫字母相異表示差異極顯著(P<0.01)。圖6同。

1.Lung; 2.Liver; 3.Testis; 4.Muscle; 5.Ovary; 6.Spleen; 7.Mammary gland; 8.Kidney; 9.Stomach;10.Heart;n=3; Reference gene.β-actin； Different capital letters means extremely significant difference between the treatments(P<0.01).The same as Fig.6.

圖5HDAC8在牦牛不同組織中的表達(dá)模式
Fig.5 Expression pattern ofHDAC8in different tissues of yak

圖6 HDAC8在牦牛卵母細(xì)胞不同 發(fā)育階段中的相對表達(dá)水平Fig.6 HDAC8 mRNA relative expression at different stages of oocytes development in yak

3 討論與結(jié)論

組蛋白乙?；揎棇虮磉_(dá)及細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控至關(guān)重要,其中去乙?；讣易迮c染色體易位、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因沉默、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和增殖以及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[19]。HDAC8作為人源Ⅰ類組蛋白去乙?；?其廣泛分布和表達(dá)于人類細(xì)胞核內(nèi)[20]。本研究克隆獲得牦牛HDAC8序列,與黃牛、綿羊和人類等的序列進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn),牦牛與上述物種有較高的序列相似性,表明HDAC8在哺乳類動物間的進(jìn)化過程及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)水平上的保守性較強(qiáng)。此外,HDAC8與HDAC1～3不同,其較早產(chǎn)生分歧進(jìn)化,可能導(dǎo)致其不同的功能特化[21]。除催化核心結(jié)構(gòu)域外,HDAC8不具有C末端的延伸區(qū)域,并且HDAC8蛋白單獨(dú)具去乙?；富钚砸约暗孜镞x擇性,其可能相對獨(dú)立地行使功能[22]。然而,HDAC8能夠與體內(nèi)某些蛋白質(zhì)結(jié)合,蛋白質(zhì)之間的相互作用可能影響其生物學(xué)功能和底物選擇性[22]。Deardorff等[16]研究發(fā)現(xiàn),HDAC8的體內(nèi)底物為某些特殊的非組蛋白,其中就包括染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白SMC3；HDAC8可直接使SMC3去乙?；?并且還可能會作為支架蛋白,以復(fù)合物方式募集底物蛋白。本研究中,蛋白相互作用分析發(fā)現(xiàn),HDAC8蛋白可能與SMC3等多種蛋白相互作用,進(jìn)而在細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。

Buggy等[20]研究發(fā)現(xiàn),HDAC8在人的肺臟、心臟和腎臟中均有表達(dá),其中在肝臟中的表達(dá)量最高。利用qRT-PCR技術(shù)測定HDAC8在牦牛各類組織中的表達(dá)規(guī)律,結(jié)果顯示,HDAC8在牦牛各類組織中普遍表達(dá),且在肝臟中的表達(dá)水平最高,與Buggy等[20]的研究結(jié)果相似。HDAC3與HDAC8同屬Ⅰ類組蛋白去乙酰化酶,二者同源性較高[20]。同時,Farooq等[23]研究發(fā)現(xiàn),HDAC3在維持肝臟代謝穩(wěn)態(tài)的平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,特異性敲除成年小鼠肝臟中的HDAC3后,空腹血糖和胰島素水平明顯低于野生型。因此,推測HDAC8也有可能對牦牛肝臟的代謝發(fā)揮一定的調(diào)控作用。

細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；接梢阴；D(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferase,HAT)和去乙酰化酶 (Histone deacetyltransferase,HDAC) 共同調(diào)控,二者可以改變組蛋白表面賴氨酸殘基所帶電荷,進(jìn)而影響染色質(zhì)的凝集或疏松程度并調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[24]。組蛋白乙酰化調(diào)節(jié)在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中起重要作用,在此期間,卵母細(xì)胞中組蛋白乙?；瘏⑴c染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變和基因表達(dá)的調(diào)控[24]。染色質(zhì)的凝集是卵母細(xì)胞走向成熟過程中一個可見的生物學(xué)過程,在此過程中纖維狀的染色質(zhì)被包裝形成染色體,并在隨后的細(xì)胞分裂過程中分離進(jìn)入子細(xì)胞,組蛋白去乙?；谷旧|(zhì)處于凝集狀態(tài),從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄[24]。qRT-PCR分析HDAC8在牦牛卵母細(xì)胞成熟階段(GV、MⅠ和MⅡ期)中的表達(dá)規(guī)律,結(jié)果表明,HDAC8隨著卵母細(xì)胞成熟階段的遞增呈上升趨勢,MⅡ期極顯著高于GV和 MⅠ期。有研究表明,在多種哺乳動物,如小鼠、綿羊、豬及牛的生發(fā)泡(Germinal vesicle,GV)期卵母細(xì)胞中H4組蛋白的H4K16處于高乙酰化水平,在卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂(Germinal vesicle breakdown,GVBD)期后,即染色質(zhì)開始凝集轉(zhuǎn)變成染色體的時刻會發(fā)生去乙?；?隨著減數(shù)分裂的再次激活,H4K16進(jìn)行了去乙酰化,這種狀態(tài)一直持續(xù)到第二次減數(shù)分裂中期(Meiotic metaphaseⅡ,MⅡ)結(jié)束[25],并且牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中H4組蛋白乙?；厔菖c小鼠相似[26],與本試驗(yàn)數(shù)據(jù)基本相符合。推測在牦牛卵母細(xì)胞GV和MⅠ期中的低HDAC8mRNA水平與H4K16乙?；嘘P(guān),HDAC8可能對牦牛卵母細(xì)胞的成熟有一定的調(diào)控作用。

本研究克隆獲得牦牛HDAC8基因CDS序列1 008 bp,編碼335個氨基酸,序列分析表明，HDAC8在哺乳類動物間的進(jìn)化過程及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)水平上保守性較高。組織表達(dá)及卵母細(xì)胞成熟過程中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),HDAC8在牦牛肝臟組織中的表達(dá)量最高,隨著卵母細(xì)胞成熟階段的遞增,HDAC8的表達(dá)呈上升趨勢,MⅡ期極顯著高于GV和 MⅠ期。本試驗(yàn)結(jié)果可以為進(jìn)一步探索HDAC8在牦牛生殖中的調(diào)控作用提供一定的理論基礎(chǔ)。