影響溫敏核不育水稻育性轉(zhuǎn)換的低溫敏感度QTL定位

梁鐵軍,陳雄輝,崔玉梅,羅方雄,張澤民,彭海峰

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 廣東 廣州 510642)

水稻是我國主要的糧食作物之一,其產(chǎn)量的提高主要依賴于雜種優(yōu)勢的利用。水稻光溫敏核不育系的發(fā)現(xiàn),使兩系法利用水稻雜種優(yōu)勢成為可能。由于該不育系的育性轉(zhuǎn)換受光周期和溫度的調(diào)控,可以一系兩用,不育期雜交制種,可育期自交繁種[1]。目前,生產(chǎn)上廣泛使用的是長光高溫不育而短光低溫可育的光溫敏核不育系,要求在長光高溫條件下不育性穩(wěn)定制種安全而在短日低溫條件下育性易恢復(fù)繁種容易。對于這類光溫敏核不育系,已報(bào)道定位的不育基因有pms1[2-3]、pms2[2,4]、pms3[5]、pms4[6]、OsPCD5[7]、tms1[8]、tms2[9-10]、tms3[11]、ms-h[12]、tms4[13]、TGMS[14]、tms5[15-17]、tms6(t)[18]、tms6[19]、tmsX[20]、ptgms2-1[21]、tms8[22]、p/tgms12-1[23]、tms9[24]和tms9-1[25],其中pms1[26]、pms3[27]、p/tgms12-1[23]、OsPCD5[7]、ms-h[28-29]和tms5[30]已被克隆和功能分析。但在同一不育基因控制下的不同光溫敏核不育系,由于受遺傳背景的影響不育基因的表達(dá)仍然存在差異。對于異常低溫影響光溫敏核不育系制種安全的不育性不穩(wěn)定問題,前人已從不育臨界溫度[31-34]、低溫耐受度[35-38]等方面進(jìn)行了較多研究,選育不育臨界溫度低且耐受低溫時間長的不育系以降低制種風(fēng)險(xiǎn)已是共識。然而,對于影響光溫敏核不育系自交繁種的育性恢復(fù)難易問題,研究相對較少,陳雄輝等[39]認(rèn)為除光溫臨界值外,育性的光溫敏感度對繁種產(chǎn)量也有重要影響,對于光溫反應(yīng)類型及光溫臨界值極相近的2個不育系,敏感度高的不育系,一旦可育的光溫條件滿足,育性就迅速恢復(fù)并有較高的結(jié)實(shí)率,而敏感度低的不育系,可育的光溫條件達(dá)到后育性恢復(fù)緩慢。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,He等[40]以農(nóng)墾58S來源的培矮64S和8902S為材料,通過不同光溫處理定位了影響制種的光敏核不育性不穩(wěn)定性QTLL2、L3a、L3b、L5、L6、L7和L10和影響繁種的育性可轉(zhuǎn)換性QTLS2、S3a、S3b、S5、S8和S10。本研究將以冷繁結(jié)實(shí)率存在明顯差異的溫敏核不育水稻N38S和N727S為材料,定位影響繁種育性轉(zhuǎn)換的低溫敏感度QTL,可為實(shí)用型光溫敏核不育水稻的分子標(biāo)記輔助選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以冷水灌溉30 d后自交結(jié)實(shí)率存在明顯差異的水稻溫敏核不育系N38S(來源于華68S,自交結(jié)實(shí)率實(shí)生苗4.3%,禾頭6.7%)和N727S(來源于秈S,自交結(jié)實(shí)率實(shí)生苗90.0%,禾頭73.3%)為材料,通過人工氣候箱21.0 ℃低溫處理獲得可育材料與田間不育材料進(jìn)行雜交獲得F1,F1自交獲得F2定位群體。試驗(yàn)材料種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場試驗(yàn)田。

1.2 育性轉(zhuǎn)換的鑒定

將發(fā)育至幼穗分化第Ⅳ期(即雌雄蕊原基分化期)的親本N38S、N727S及其F1、F2群體移入人工氣候箱(加拿大Conviron PGV36),箱內(nèi)溫度設(shè)置為加權(quán)平均溫22.17 ℃(表1),光照時間設(shè)置為11.5 h,光照度為1. 0 × 104lx,RH≥75%。當(dāng)?shù)蜏靥幚碇羻沃瓿樗霑r,從抽穗單株上選取3穗的中上部穎花3～6朵,鏡檢時將每穗花藥混合壓片,用1% I2-KI溶液染色,將花粉圓形、深染色的計(jì)為正?？捎ǚ?其他皆計(jì)為敗育花粉(包括無花粉、典敗、圓敗、染敗),然后統(tǒng)計(jì)花粉可染率,單株的花粉育性為3穗花粉可染率的平均值。

1.3 SSR標(biāo)記分析

葉片DNA提取采用TPS簡易抽提法,SSR引物由廣州睿博興科生物技術(shù)有限公司合成,PCR擴(kuò)增參照Panaud等[41]的方法稍加修改進(jìn)行,對PCR產(chǎn)物的檢測采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染的方法。

1.4 分子遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及QTL分析

運(yùn)用Mapmaker 3.0及WinQTLCart 2.5軟件對溫敏核不育水稻進(jìn)行育性轉(zhuǎn)換的低溫敏感度QTL分析的數(shù)據(jù)處理。Mapmaker 3.0用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜,得到各標(biāo)記間的遺傳連鎖距離(cM)；WinQTLCart 2.5用于生成LOD曲線,確定QTL位點(diǎn)及在染色體上的分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 F2定位群體的表型分析

經(jīng)人工氣候箱低溫處理至抽穗,N38S的花粉育性為1.0%,N727S的花粉育性為65.0%,F1的花粉育性為67.5%,108株F2群體單株的花粉育性分布見圖1。由圖1可知,F2群體單株花粉育性呈連續(xù)分布,符合數(shù)量遺傳的特點(diǎn),可結(jié)合基因型鑒定結(jié)果對影響溫敏核不育水稻育性轉(zhuǎn)換的低溫敏感度QTL進(jìn)行檢測分析。

2.2 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

選取擴(kuò)增效果較好且基本均勻分布于水稻12條染色體上的363對SSR標(biāo)記對N38S和N727S進(jìn)行親本間的多態(tài)性分析。結(jié)果顯示,有78對SSR標(biāo)記在親本間表現(xiàn)出多態(tài)性,多態(tài)率為21.5%。利用親本間的多態(tài)標(biāo)記對N38S×N727S的F2群體單株進(jìn)行基因型分析,并運(yùn)用Mapmaker 3.0軟件對F2群體單株的表型鑒定數(shù)據(jù)和多態(tài)標(biāo)記帶型數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳連鎖分析,構(gòu)建基于SSR標(biāo)記的分子遺傳連鎖圖譜。結(jié)果顯示,相互連鎖的SSR標(biāo)記構(gòu)成8個連鎖群,分別位于水稻的第1,4,7,8,9,10,11,12染色體上(圖2)。

圖1 N38S×N727S的108株F2群體單株的花粉育性分布Fig.1 Distribution of pollen fertility of 108 F2 plants from the cross of N38S and N727S

圖2 遺傳連鎖群在水稻染色體上的分布Fig.2 Distribution of genetic linkage group on chromosomes in rice

2.3 育性轉(zhuǎn)換的低溫敏感度QTL定位

運(yùn)用WinQTLCart 2.5軟件對各連鎖群上的QTL進(jìn)行分析,一般當(dāng)LOD>2.5時即認(rèn)為存在QTL。通過復(fù)合區(qū)間作圖法,檢測到3個低溫敏感度QTL位點(diǎn),分別命名為QTL1、QTL2和QTL3,其中QTL1位于第1染色體的PSM12與RM583標(biāo)記區(qū)間,QTL2位于第4染色體的PSM194與RM273標(biāo)記區(qū)間,QTL3位于第4染色體的RM273與PSM103標(biāo)記區(qū)間(圖3)。

圖3 影響溫敏核不育水稻育性轉(zhuǎn)換的低溫敏感度QTL分析的LOD曲線Fig.3 LOD curve of QTL analysis on low temperature sensitivity affecting fertility reversibility in TGMS rice

對定位的3個QTL進(jìn)行遺傳效應(yīng)分析的結(jié)果見表2。由表2可知,3個QTL位點(diǎn)的加性效應(yīng)值均為負(fù)值,分別為-12.14,-19.65,-10.40；顯性效應(yīng)值均為正值,分別為21.63,16.59,42.46；它們對育性轉(zhuǎn)換的貢獻(xiàn)率分別為7%,16%,3%。

表2 復(fù)合區(qū)間作圖法檢測到的低溫敏感度QTLTab.2 QTLs of low temperature sensitivity detected by composite interval mapping method

3 討論與結(jié)論

一個優(yōu)良的光溫敏核不育系既要制種安全又要繁種容易。本研究利用SSR標(biāo)記對影響溫敏核不育水稻自交繁種的育性轉(zhuǎn)換進(jìn)行了低溫敏感度QTL定位,獲得3個QTL位點(diǎn),其中QTL1位于第1染色體的標(biāo)記PSM12(2 606 kb)與RM583(8 329 kb)之間,QTL2和QTL3分別位于第4染色體的PSM194(20 032 kb)與RM273(24 048 kb)之間和RM273(24 048 kb)與PSM103(32 060 kb)之間(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。這3個在低溫條件下定位的QTL位點(diǎn)與He等[40]在短日條件下定位的6個影響繁種的育性可轉(zhuǎn)換性QTL位點(diǎn),即S2、S3a、S3b、S5、S8和S10位于不同的染色體上,因而彼此并不等位。而在已定位的光溫敏核不育基因中,CSA位于第1染色體上[42],pms4位于第4染色體上[6],通過基于連鎖標(biāo)記的序列查詢和Blast分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)可知,QTL1位于第1染色體標(biāo)記RM583(8 329 kb)的上側(cè),與已報(bào)道的位于第1染色體標(biāo)記RM292(9 566 kb)下側(cè)的CSA不等位；QTL2和QTL3均位于第4染色體PSM194(20 032 kb)的下側(cè),與已報(bào)道的位于第4染色體RM6659(6 576 kb)下側(cè)3.0 cM處的pms4相距較遠(yuǎn)。因此,本研究定位的3個影響溫敏核不育水稻育性轉(zhuǎn)換的低溫敏感度QTL區(qū)間可能存在新的基因位點(diǎn),并且這3個QTL位點(diǎn)的加性效應(yīng)均為負(fù)值,說明N727S攜帶的等位基因增加花粉可育率和結(jié)實(shí)率,在利用分子標(biāo)記輔助選擇時,對QTL1、QTL2、QTL3應(yīng)該選擇N727S的標(biāo)記類型,以提高自交繁種的產(chǎn)量。在3個QTL中,QTL2的低溫敏感性最強(qiáng),對于育性轉(zhuǎn)換的貢獻(xiàn)最大。本研究對3個低溫敏感度QTLs的定位,將在利用分子標(biāo)記輔助選擇易于轉(zhuǎn)育繁種的溫敏核不育水稻方面發(fā)揮重要作用。