基于QTL-seq的水稻粒質(zhì)量QTL定位及候選基因分析

王 豪,張 健,王加峰,楊瑰麗,郭 濤,陳志強(qiáng),王 慧

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心,廣東 廣州 510642)

水稻是世界上最重要的糧食作物之一,全球約有一半以上人口以水稻為主食。隨著我國人口數(shù)量的不斷增加,耕地面積因氣候環(huán)境變化逐年減少,導(dǎo)致糧食安全問題日益嚴(yán)峻。只有不斷提高糧食產(chǎn)量,才能從根本上解決糧食問題。水稻千粒質(zhì)量作為重要的產(chǎn)量性狀一直是育種家關(guān)注的重點(diǎn),同時(shí)也會間接影響到品質(zhì)相關(guān)性狀。水稻千粒質(zhì)量是多基因控制的數(shù)量性狀,是由主效基因和一些分布不均衡的微效多基因共同作用的,所以進(jìn)一步定位和克隆新的控制粒質(zhì)量的基因是十分必要的[1]。水稻千粒質(zhì)量由籽粒的體積和飽滿度決定,其中水稻籽粒體積一般由粒長、粒寬和粒厚決定,飽滿度一般由灌漿速率、活躍灌漿期時(shí)間等指標(biāo)衡量[2]。近年來已經(jīng)有很多控制粒型的基因被克隆,目前克隆的大部分控制水稻粒型的基因是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子途徑、油菜素內(nèi)酯、G-蛋白信號、生長素以及泛素連接酶途徑調(diào)控水稻粒型性狀。其中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子調(diào)控粒型途徑如GS2(GL2、LGS1)編碼蛋白質(zhì)可以與DELLA蛋白產(chǎn)生互作,作用于赤霉素信號傳導(dǎo)途徑,可以促進(jìn)氮元素的吸收和在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn),同時(shí)調(diào)控植物的光合作用、碳水化合物的代謝和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等,通過促進(jìn)水稻細(xì)胞分裂和膨大調(diào)節(jié)水稻粒長和粒質(zhì)量[3-4]。最新研究表明,GS2基因突變可能影響OsGRF-miR396脅迫響應(yīng)應(yīng)答,從而增強(qiáng)水稻苗期的耐冷性[5],也表明了GS2基因存在一因多效。GW8編碼包含SBP結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,能夠與GW7啟動子結(jié)合并抑制其表達(dá),導(dǎo)致水稻籽粒變短圓[6]。GS9編碼轉(zhuǎn)錄激活因子與OFPs家族蛋白(轉(zhuǎn)錄抑制家族)OsOFP14和OsOFP8相互作用通過影響細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)水稻粒長、粒寬和外觀品質(zhì)[7]。編碼G-蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,如GS3負(fù)調(diào)節(jié)水稻粒質(zhì)量和粒長,蛋白表達(dá)主要在水稻幼穗,隨著幼穗的發(fā)育表達(dá)量逐漸減少,在其他組織如葉片、胚芽、莖端分生組織中有微弱表達(dá),在根中大量表達(dá)[8]。泛素連接酶途徑,如GW2編碼環(huán)型E3泛素連接酶,通過在細(xì)胞質(zhì)中調(diào)節(jié)底物與受體酶的結(jié)合降解,從而負(fù)調(diào)節(jié)水稻細(xì)胞的分裂,影響粒寬和粒質(zhì)量[9]。GW2等位基因WY3因功能缺失,無法促使底物被識別降解,從而可以激活穎殼外稃的細(xì)胞分裂,增加了灌漿速率,顯著增加水稻的粒寬和千粒質(zhì)量,同時(shí)也正調(diào)控水稻單株穗數(shù)、延長生育期,并顯著地降低每穗粒數(shù)和主穗長度[10]。調(diào)控生長素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,如TGW6編碼IAA-葡萄糖水解酶,控制IAA-葡萄糖的水解,通過影響細(xì)胞分裂從而負(fù)調(diào)控籽粒質(zhì)量[11]。TGW3(GL3.3)編碼蛋白激酶OsSK41能夠磷酸化生長素應(yīng)答因子OsARF4(生長素途徑中的轉(zhuǎn)錄抑制因子)。OsSK41-OsARF4通過負(fù)調(diào)控生長素信號,調(diào)節(jié)水稻穎殼中細(xì)胞的大小和數(shù)量,進(jìn)而負(fù)調(diào)控水稻粒長和粒質(zhì)量[12-13]。同時(shí)TGW3與之前發(fā)現(xiàn)的GS3存在上位性效應(yīng),GS3與TGW3同時(shí)存在可以導(dǎo)致水稻粒型的顯著增大[14]。油菜素內(nèi)酯調(diào)控途徑,如GW5編碼蛋白調(diào)節(jié)油菜素內(nèi)酯信號傳導(dǎo),可以通過與GSK2激酶相互作用從而抑制GSK2激酶活性。GSK2激酶可以磷酸化OsBZR1和DLT蛋白,GW5的表達(dá)會增加細(xì)胞核中未磷酸化的OsBZR1和DLT蛋白的積累,從而調(diào)節(jié)油菜素內(nèi)酯響應(yīng)基因的表達(dá)水平和生長響應(yīng)[15]。QTL-seq是近年來發(fā)展起來的一種新型的QTL定位手段,是將傳統(tǒng)的混合分組分析法(Bulk segregant analysis,BSA)和高通量測序結(jié)合起來快速定位到性狀相關(guān)QTL,節(jié)約了大量構(gòu)建群體的時(shí)間,Park 等[16]通過QTL-seq和RNA-seq技術(shù)定位了辣椒中影響辣椒素含量的主效基因,Luo等[17]通過QTL-seq和KASP分型技術(shù)定位了花生脫殼率的主效QTL。QTL-seq目前已經(jīng)在水稻粒長[18]、水稻耐寒性[19]、大白菜抗TuMV[20]、鹽脅迫下大麥的籽粒育性[21]與抗病性、西瓜枯萎病[22]、油菜有限花序[23]、鷹嘴豆粒質(zhì)量[24]、卷心菜和西蘭花開花時(shí)間[25]等研究中得到了廣泛的應(yīng)用,證明了QTL-seq在基因定位中的可行性?，F(xiàn)階段大部分水稻粒型定位研究大都是以高世代的RIL群體或染色體單片段代換系為材料,以分子標(biāo)記或高密度遺傳圖譜作為主要的定位手段進(jìn)行QTL定位,構(gòu)建群體時(shí)間長,研究成本較高。通過QTL-seq定位的遺傳位點(diǎn)報(bào)道較少。對影響粒質(zhì)量的關(guān)鍵表型性狀進(jìn)行鑒定分析,進(jìn)一步挖掘可能控制粒質(zhì)量的候選基因,豐富粒質(zhì)量性狀多基因調(diào)控的理論基礎(chǔ),以期可以在實(shí)際育種中加以應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與田間處理

材料為國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心前期收集的優(yōu)良種質(zhì)資源重粒親本B233和輕粒親本B91以及雜交繁育的F2群體。于2017年早造進(jìn)行雜交,2017年晚造種植F1(6株×6株小區(qū)),于2018年早造雙壟種植F2506株全部收獲并進(jìn)行表型考察。

所有的田間處理試驗(yàn)均在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物航天育種工程技術(shù)中心試驗(yàn)田完成,田間種植由實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一管理。

1.2 B91及B233產(chǎn)量相關(guān)性狀的考察

收獲2 a四造親本種子在溫室自然風(fēng)干,對親本進(jìn)行粒長、粒寬、千粒質(zhì)量、單株穗數(shù)、穗粒數(shù)等表型性狀的考察。

1.3 B91及B233籽粒掃描電鏡觀察

1.3.1 穎殼表面掃描電鏡觀察 水稻穎殼用2.5%～5.0%的戊二醛(采用0.1～0.2 mol/L的PBS(pH值6.8)稀釋25%戊二醛至濃度為2.5%～5.0%)固定。為了讓固定液充分浸入材料,當(dāng)穎殼放入固定液后進(jìn)行真空處理,然后在4 °C的條件下固定1～3 h后吸出固定液,加入0.1 mol/L pH值6.8的PBS漂洗1 h,期間換漂洗液3～4次；吸出PBS后用乙醇梯度干燥,即30%-50%-70%-80%-90%-100%-100%,樣品在每級乙醇中停留30 min；經(jīng)無水乙醇干燥后的穎殼用解剖針剖開,使用導(dǎo)電雙面膠粘貼在載物臺上,噴金后使用XL-30-ESEM型號掃描電鏡觀察。

1.3.2 籽粒胚乳淀粉粒掃描電鏡觀察 收獲已經(jīng)完成灌漿的水稻籽粒(本研究為開花40 d后),將成熟籽粒自然風(fēng)干后剝除穎殼,用鑷子掰開,留出中部胚乳腹部作為觀察樣本,將觀察樣本的截面用導(dǎo)電膠粘貼置于載物臺上,噴金后使用XL-30-ESEM型號掃描電鏡觀察。

1.4 B233及B91灌漿速率的測定

在水稻孕穗期選取長勢整齊的單株掛牌標(biāo)記,當(dāng)穗部露出外葉鞘3 cm時(shí),在此穗的劍葉上標(biāo)記抽穗日期,統(tǒng)一于15:00開始標(biāo)記,取樣時(shí)間也統(tǒng)一在15:00進(jìn)行。對標(biāo)記后的穗子進(jìn)行跟蹤調(diào)查,在穗子中部穎花開放的時(shí)間進(jìn)行定穗,記為開花0 d,并在開花的穎殼上用防水筆標(biāo)記。自開花的第5天起,每5 d取樣一次,直到開花的第40天粒質(zhì)量不再發(fā)生變化為止。每次每個(gè)材料取100粒,取樣均取水稻穗的優(yōu)勢粒進(jìn)行測量,保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。取回的穗子立即放入冰袋并帶回實(shí)驗(yàn)室測量鮮質(zhì)量,在60 ℃的烘箱內(nèi)烘72 h至恒質(zhì)量測量干質(zhì)量。灌漿動態(tài)用Richards方程擬合。

1.5 QTL-seq分析

對F2種子進(jìn)行粒質(zhì)量考察,在F2群體中篩選出極端輕粒單株30株和極端重粒單株30株,各取葉片2 g,用CTAB法提取葉片DNA,提取后測量DNA濃度和純度,根據(jù)濃度等量混合F2群體的DNA。

2個(gè)混合池DNA和2個(gè)親本DNA建庫進(jìn)行30×的全基因組重測序,測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾后進(jìn)行SNPs和InDels注釋。以對照親本作為參考,計(jì)算每個(gè)子代混合池在所有的SNP分離位點(diǎn)的親本基因型頻率,即SNP-index。采用滑動窗口策略來繪制2個(gè)子代混合池的SNP-index圖(以2 Mb為窗口,100 kb為步長),并過濾掉2 M范圍內(nèi)小于10個(gè)SNP位點(diǎn)的區(qū)域。為了減少測序錯(cuò)誤和比對錯(cuò)誤的影響,同時(shí)過濾掉子代SNP-index都小于0.3,SNP深度都小于6的位點(diǎn)。得到2個(gè)子代混合池的SNP-index圖后,計(jì)算分離位點(diǎn)在子代2個(gè)極端池中基因頻率的差值(△SNP-index),然后采取滑動窗口的策略繪圖。并進(jìn)行1 000次置換檢驗(yàn),選取99%置信水平作為選取的閾值,超過閾值外的區(qū)域?yàn)闈撛诘腝TL候選區(qū)域。對候選SNPs所在的編碼基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)掘潛在的與性狀相關(guān)的候選基因。

1.6 注釋基因功能及表達(dá)位置分析

通過國家水稻數(shù)據(jù)中心對于注釋基因的蛋白結(jié)構(gòu)域注釋和預(yù)測功能及NCBI網(wǎng)站對候選區(qū)域內(nèi)注釋基因的轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)一步篩選候選基因。

1.7 數(shù)據(jù)處理

表型數(shù)據(jù)的錄入、整理與柱狀圖由Excel 2016完成,使用SPSS 20完成數(shù)據(jù)相關(guān)性及方差分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本表型性狀的鑒定和掃描電鏡觀察

2.1.1 B233和B91的表型性狀對比 2 a共四造對B233和B91籽粒形態(tài)進(jìn)行調(diào)查(圖1),B91與B233粒長、粒寬、粒厚、千粒質(zhì)量均具有顯著差異,其中以千粒質(zhì)量差異最大,所以在F2群體中以千粒質(zhì)量作為主要考察性狀進(jìn)行極端單株的篩選,構(gòu)建混合池。

不同字母表示親本間差異極顯著(P<0.01)。 Different letters indicate extremely significant difference (P<0.01)between B233 and B91.

2.1.2 B91與B233灌漿速率對比 灌漿速率等相關(guān)指標(biāo)也會直接影響籽粒充實(shí)度并影響到最終粒質(zhì)量,所以本研究對比了B91及B233灌漿速率(圖2)的相關(guān)指標(biāo)。B91的起始生長勢、活躍灌漿期時(shí)間、平均灌漿速率、最大灌漿速率等指標(biāo)均小于B233(表1)。其中平均灌漿速率、活躍灌漿期等指標(biāo)都直接或間接影響最終籽粒質(zhì)量。灌漿動態(tài)指標(biāo)也是導(dǎo)致B233和B91粒質(zhì)量差異和品質(zhì)差異的重要因素之一。

圖2 B91和B233灌漿速率的比較Fig.2 Comparison of the filling rates of B91 and B233

表1 Richards方程擬合灌漿參數(shù)Tab.1 Richards equation fitting grout parameters

注:A.籽粒終極生長量；R0.起始生長勢；Rmax.最大灌漿速率；Rmean.平均灌漿速率；Dmax.達(dá)到最大灌漿速率的時(shí)間；Wmax.灌漿速率最大時(shí)的籽粒質(zhì)量；D.活躍灌漿期；R2.方程系數(shù)。

Note: A.Grain final growth; R0.Initial growth potential; Rmax.Maximum grouting rate; Rmean.Average grouting rate; Dmax.Time to reach the maximum grouting rate; Wmax.Grain weight when the grouting rate is maximum; D.Active grouting period;R2.Coefficient of equation.

2.1.3 B233和B91穎殼表面和胚乳的顯微觀察和掃描電鏡觀察 由150×、500×和1 000×掃描電鏡視圖(圖3)可以看到,細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)量在親本間均有明顯差異,表明二者為B91和B233粒型差異的決定因素。根據(jù)300×掃描電鏡觀察,單位面積內(nèi)B91縱向細(xì)胞列數(shù)與B233縱向細(xì)胞列數(shù)相比有顯著差異,橫向細(xì)胞行數(shù)沒有顯著差異；穎殼細(xì)胞長和細(xì)胞寬均有極顯著差異(表2)。

B91精米細(xì)長,米質(zhì)堅(jiān)硬,米粒亮透明如玻璃狀,米粒大小均勻,胚乳整齊美觀,無腹白心白,對B91成熟籽粒腹部胚乳細(xì)胞的掃描電鏡觀察淀粉粒呈明顯的多邊形、排列緊密、顆粒間基本沒有空隙,

A-C.B91掃描電鏡視圖；D-F.B233掃描電鏡視圖；A,D.觀察倍數(shù)150×;B,E.觀察倍數(shù)500×；C,F.觀察倍數(shù)1 000×。 A-C.B91 scanning electron microscope view; D-F.B233 scanning electron microscope view; A, D. Observation multiple 150 ×;B, E. Observation multiple 500×; C, F. Observation multiple 1 000×.

表2 300×掃描電鏡視圖穎殼單位面積下細(xì)胞長寬和細(xì)胞數(shù)量對比
Tab.2 Comparison of cell length and width and cell number per unit area in 300× scanning electron microscope

樣品Sample 細(xì)胞長(平均)/μmCell length 細(xì)胞寬(平均)/μmCell width橫向細(xì)胞行數(shù)(平均)/個(gè) Horizontal cell number 縱向細(xì)胞列數(shù)(平均)/個(gè)Longitudinal cell numberB9121.875±1.567A22.768±2.301A13±0.816A18±0.943AB23331.964±1.413B30.213±1.889B12±0.943A12±0.471B

注：同列不同大寫字母表示樣品間差異極顯著。

Nota:Different capital letter represents extremely significant difference between the two samples.

A-C.B91掃描電鏡視圖；D-F.B233掃描電鏡視圖；A,D.觀察倍數(shù)300×；B,E.觀察倍數(shù)3 000×；C,F.觀察倍數(shù)6 000×。 A-C.B91 scanning electron microscope view; D-F.B233 scanning electron microscope view; A,D. Observation multiple 300×； B,E. Observation multiple 3 000×; C,F. Observation multiple 6 000×.

籽粒填充度較好(圖4-A-C)。B233具腹白或心白,稻米品質(zhì)比B91稍差,對B233成熟籽粒腹部胚乳細(xì)胞進(jìn)行掃描電鏡觀察籽粒淀粉粒多面體的棱角不明顯,部分淀粉粒有橢圓形、排列疏松、顆粒間存在較大空隙、透光性稍差(圖4-D-F)。

2.2 QTL-seq分析

2.2.1 F2群體粒質(zhì)量分布及遺傳分析 水稻輕粒親本B91和重粒親本B233雜交獲得F1,自交得F2,分別考察粒型相關(guān)性狀。F1及F2群體平均粒長、粒寬、粒厚和千粒質(zhì)量介于兩親本之間(表3),對F2群體共506個(gè)單株進(jìn)行粒質(zhì)量的考察,粒質(zhì)量分布呈標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布(圖5),表明在B233和B91中控制親本粒質(zhì)量性狀的為數(shù)量位點(diǎn)基因,F2群體粒質(zhì)量極端值明顯,是良好的QTL-seq作圖群體。挑選了粒質(zhì)量極值單株各30株,方差分析顯示，選取的單株粒質(zhì)量具有極顯著差異,可以用作測序樣本。分別提取單株葉片DNA并留種。

表3 水稻親本、F1(mean)、F2(mean) 粒長、粒寬、粒厚、千粒質(zhì)量Tab.3 B91 (mean), B233 (mean), F1 (mean), F2 (mean) grain length, grain width, grain thickness, thousand grain weight

圖5 F2群體粒質(zhì)量分布Fig.5 Grain weight distribution in the F2

2.2.2 基于雙親分離SNP標(biāo)記的BSA 將從群體中篩選出雙親分離的SNP作為標(biāo)記,以便后續(xù)進(jìn)行BSA法QTL定位(QTL-seq)。過濾獲得可以用于后續(xù)QTL-seq分析的有效SNP位點(diǎn)共430 762個(gè)。SNP窗口總數(shù)量為3 620個(gè),SNP數(shù)量 ≥ 10的窗口數(shù)量為3 234個(gè),占SNP窗口總數(shù)量的89.34%。根據(jù)雙親分離的SNP標(biāo)記定位粒質(zhì)量相關(guān)的QTL(圖6)。

以2個(gè)子代SNP-index作差,計(jì)算△(SNP-index)。計(jì)算過程進(jìn)行1 000次置換檢驗(yàn),獲得各個(gè)位點(diǎn)以及窗口的△(SNP index)95%置信區(qū)間(藍(lán)色閾值線,即相當(dāng)于P=5%),以及99%置信區(qū)間(紅色閾值線,即相當(dāng)于P=1%)。

With the difference of two daughter SNP-index, calculate △ (SNP-index). The calculation process performs 1 000 displacement tests to obtain a △ (SNP index) 95% confidence interval for each site and window (blue threshold line, which is equivalent toP=5%), and a 99% confidence interval (red threshold line, That is equivalent toP=1%).

圖6 Δ(SNP index)總分布圖
Fig.6 Total distribution of Δ(SNP index)

因?yàn)閮捎H本遺傳背景差異較大,前期未對兩親本遺傳背景進(jìn)行人為純化,故本次QTL-seq分析定位到的粒質(zhì)量QTL數(shù)量較多,且本次QTL-seq分析結(jié)果比較理想。為了更有針對性的對粒質(zhì)量性狀進(jìn)行分析,因?yàn)檎{(diào)控大粒的QTL在育種中更具有研究價(jià)值,所以在本研究主要關(guān)注超過正閾值區(qū)99%置信區(qū)間的QTL位置,并進(jìn)一步在這些QTL區(qū)間內(nèi)篩選可能調(diào)控粒質(zhì)量的基因?？梢钥吹皆谒镜?,4,5號染色體上共有5個(gè)與粒質(zhì)量性狀相關(guān)的QTL區(qū)間(圖6),其中2號染色體和4號染色體的2個(gè)QTL峰值最為明顯。在正閾值區(qū)內(nèi)定位到的5個(gè)QTL最小的物理區(qū)間為2.1 M(Chr2:20.9～23.0 M),最大的物理區(qū)間6.3 M(Chr4:28.9～35.2 M)(表4)。

表4 水稻粒質(zhì)量QTL物理位置 Tab.4 Physical location of rice grain weight QTL

2.3 正閾值區(qū)內(nèi)候選基因的篩選

2.3.1 正閾值區(qū)△(SNP-index)>0.7 SNP位點(diǎn)和InDel位點(diǎn)的篩選 對正閾值區(qū)QTL位點(diǎn)內(nèi)的基因進(jìn)行△(SNP-index)分析,重點(diǎn)關(guān)注在子代混合池內(nèi)△(SNP-index)在0.7以上的SNP位點(diǎn),選出在23個(gè)基因發(fā)生非同義突變及剪接位點(diǎn)上的突變(表5),同時(shí)選出11個(gè)基因的Indel位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步分析(表6)。共篩選出34個(gè)候選基因，其中32個(gè)基因未報(bào)道克隆，這些位點(diǎn)可能對應(yīng)影響粒型性狀的候選基因。

表5 正閾值區(qū)內(nèi)候選基因的注釋信息Tab.5 Annotation information of candidate genes in the positive threshold region

注:SNP位點(diǎn)為△(SNP-index)>0.7的位點(diǎn)。

Note: The SNP locus is a locus with △(SNP-index)>0.7.

表6 Indel位點(diǎn)篩選Tab.6 Indel site screening

2.3.2 注釋基因的轉(zhuǎn)錄組信息篩選及預(yù)測功能分析 查詢NCBI網(wǎng)站注釋基因的轉(zhuǎn)錄組信息,主要篩選出在種子和花中特異表達(dá)的基因(圖7),同時(shí)根據(jù)基因的預(yù)測功能對定位到的基因進(jìn)行篩選,共獲得6個(gè)可能與粒質(zhì)量性狀相關(guān)的候選基因:Os04g0653100、Os04g0617600、Os04g0624600、Os04g0631000、Os04g0619600、Os02g0611450。其中,Os04g0617600、Os04g0619600編碼蛋白激酶或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子作用,調(diào)控細(xì)胞凋亡、分化、增殖等細(xì)胞周期和生物合成等過程；Os04g0624600、Os04g0631000與碳水化合物的合成與分解相關(guān),可能調(diào)控稻米的粒型與品質(zhì)；Os04g0653100編碼蛋白控制生物大分子的運(yùn)輸,同時(shí)也是花粉壁細(xì)胞的重要組成成分；Os02g0611450編碼的蛋白質(zhì)可能調(diào)控生物大分子的合成和細(xì)胞周期。

圖7 NCBI網(wǎng)站中注釋基因的轉(zhuǎn)錄組信息Fig.7 Transcriptome information of annotated genes in the NCBI website

3 討論與結(jié)論

3.1 粒長、粒寬、粒厚和灌漿指標(biāo)是影響粒質(zhì)量的關(guān)鍵生理性狀

千粒質(zhì)量既是決定水稻單產(chǎn)的重要指標(biāo)之一,也是衡量水稻品種優(yōu)良與否的重要因素。本研究通過掃描電鏡觀察水稻穎殼和胚乳,旨在細(xì)胞層面解釋親本粒質(zhì)量之間的差異。根據(jù)水稻穎殼掃描電鏡觀察,B233與B91粒長、粒寬、粒厚之間的差異由細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)量共同決定[26]。水稻籽粒堊白的形成主要是由于水稻胚乳中存在淀粉顆粒區(qū)域性的排列松散而導(dǎo)致胚乳腹部存在一些空腔,而這些空腔的存在除了會影響稻米品質(zhì)之外,因?yàn)楣酀{不充分,也會影響到水稻籽粒質(zhì)量等相關(guān)性狀[27]。通過Richards對灌漿速率曲線進(jìn)行擬合,導(dǎo)出相關(guān)灌漿參數(shù),B233最大灌漿速率,活躍灌漿時(shí)期等指標(biāo)均大于B91,這些指標(biāo)直接影響到籽粒質(zhì)量。根據(jù)朱慶森等[28]的方法,因?yàn)镹>1,所以(W/A)N>W/A,可以視為庫容對灌漿速率較小,所以B91和B233均屬于源限制性品種,所以受播種環(huán)境灌漿物質(zhì)影響較大,邊緣效應(yīng)體現(xiàn)的較為明顯,所以在粒質(zhì)量調(diào)查中應(yīng)盡量保證在同一生長條件下進(jìn)行考察。因此,水稻籽粒長、寬、厚以及胚乳形態(tài)灌漿速率等是考察水稻粒質(zhì)量的重要指標(biāo),對控制這些性狀遺傳位點(diǎn)的挖掘具有重要意義。

3.2 QTL-seq是鑒定粒質(zhì)量遺傳位點(diǎn)的有效手段

目前,大多數(shù)QTL定位研究采用傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記來定位遺傳位點(diǎn),如SSR標(biāo)記、RFLP標(biāo)記等,但是傳統(tǒng)遺傳標(biāo)記開發(fā)成本較高,在水稻染色體上覆蓋密度低,分布不均勻等問題制約了相關(guān)遺傳定位研究[29]。同時(shí)開發(fā)高密度遺傳圖譜的成本也較高,同時(shí)材料選擇也十分重要,構(gòu)建群體的時(shí)間也較長,不適宜大規(guī)模使用[30]。本研究是基于全基因組重測序的高密度SNP標(biāo)記進(jìn)行QTL-seq分析,而QTL-seq技術(shù)的發(fā)展很好地解決了構(gòu)建群體時(shí)間長,測序費(fèi)用昂貴等問題。在本研究通過使用2個(gè)秈稻親本B91及B233構(gòu)建的F2群體進(jìn)行QTL-seq分析,在正閾值區(qū)共定位到了5個(gè)與粒質(zhì)量相關(guān)的QTL,通過分析測序數(shù)據(jù)篩選出△(SNP-index)>0.7的位點(diǎn)和InDel位點(diǎn),共在正閾值區(qū)篩選出34個(gè)候選基因(SNP突變基因23個(gè),Indel突變基因11個(gè)),其中包括2個(gè)已經(jīng)克隆的基因:NAL1(Chr4)[31]、OsJAZ1(Chr4)[32]。NAL1主要在葉鞘、葉片、莖稈和幼穗中表達(dá),主要影響水稻葉片的寬窄[31]、OsJAZ1是一個(gè)茉莉酮酸酯ZIM結(jié)構(gòu)域蛋白。OsJAZ1和OsCOI1b之間相互作用影響水稻小穗發(fā)育,OsJAZ1主要在幼穗和花中表達(dá)[32],這些基因在一定程度上影響水稻的產(chǎn)量。這些共定位結(jié)果一方面驗(yàn)證了本研究的可靠性,另一方面在前人的研究中均未提及這2個(gè)基因?qū)τ谒玖Ｙ|(zhì)量及相關(guān)性狀的影響,也暗示了這些基因可能存在一因多效的情況。同時(shí)通過注釋基因功能和共篩選出32個(gè)沒有報(bào)道過的基因,為后續(xù)粒質(zhì)量基因的驗(yàn)證及功能分析提供了基礎(chǔ)。

3.3 水稻粒型性狀可能受到蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因的調(diào)控

目前，克隆與水稻粒型和產(chǎn)量相關(guān)基因很多與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、泛素連接酶和蛋白激酶磷酸化相關(guān)。本研究篩選到6個(gè)可能與粒質(zhì)量相關(guān)的基因中有2個(gè)基因編碼蛋白質(zhì)起到蛋白激酶或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子作用,Os04g0617600主要編碼AAA家族的ATP酶。AAA家族的ATP酶在植物細(xì)胞中參與許多活動,包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)水解與合成、細(xì)胞內(nèi)大分子轉(zhuǎn)運(yùn)等,同時(shí)也充當(dāng)DNA解旋酶和轉(zhuǎn)錄因子。Os04g0619600編碼的蛋白質(zhì)為蛋白激酶作用,蛋白激酶按照底物的不同可分為三類,絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶及雙特異性蛋白激酶。蛋白磷酸化在大多數(shù)細(xì)胞作用中都起到重要作用,如細(xì)胞分裂分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等。Os04g0624600編碼蛋白質(zhì)可能調(diào)控淀粉合成與分解,起到可溶性淀粉合成酶的作用,水稻中與淀粉合成相關(guān)的基因主要分為兩類,一類主要在胚乳中特異性表達(dá),另外一類在其他組織和早期胚乳發(fā)育中表達(dá)[33],本研究認(rèn)為Os04g0624600可能是第二類群淀粉合成基因,但同樣具有進(jìn)一步的研究價(jià)值。

水稻粒質(zhì)量與粒長、粒寬、粒厚及籽粒飽滿度呈顯著正相關(guān)。通過灌漿指標(biāo)和顯微觀察可以反映水稻籽粒質(zhì)量和稻米品質(zhì)。通過QTL-seq分析及分析注釋基因的預(yù)測功能和表達(dá)位置可以顯著提高候選基因的篩選效率。水稻粒質(zhì)量可能受到蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因控制。