蘆筍兩性花與雄花的碳氮比及氮化合物相關(guān)基因可變剪接的差異分析

黃 玲,韋樹谷,賴 佳,代順冬,張騫方,曾華蘭,劉 佳,劉 杭,葉鵬盛

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所, 蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點實驗室,四川 成都 610300)

蘆筍(AsparagusofficinalisL.)屬于天門冬科天門冬屬多年生植物,由于其具有較高的營養(yǎng)價值和較好的藥用保健功能而深受人們喜愛[1]。蘆筍雌雄異株,其性染色體處于植物性染色體進(jìn)化途徑的中間位置,性別表現(xiàn)出多種類型,包括雌株(XX)、雄株(XY)、超雄株(YY)和雄性雌型株(簡稱兩性株,基因型為XY)。它們之間主要的差異表現(xiàn)在花器官上。雌花具有健全的雌蕊,但雄蕊高度退化；而雄花具有發(fā)育良好的雄蕊,但雌蕊發(fā)育不完全,有的形成花柱,無柱頭,有的既無花柱也無柱頭。兩性花含有完整的雄蕊,雌蕊發(fā)育完全,含有子房、花柱和柱頭,并能正常結(jié)實[2-4]。因此,兩性花是研究植物花器官發(fā)育、性別決定與分化的特殊遺傳材料[5]。此外,由于兩性花自花或異花授粉(XY×XY→1YY +2XY +1XX),產(chǎn)生超雄株(YY)。以它作為父本產(chǎn)生的后代全部為雄株(XX×YY→XY )。已有研究表明,蘆筍雄株產(chǎn)量較同期雌株高[6],因此培育全雄品種是蘆筍育種的重要方向,而兩性株是培育蘆筍全雄品種的重要資源材料。但自然界中存在的兩性株極少,這極大地限制了蘆筍種質(zhì)資源創(chuàng)新和全雄品種選育。因此,研究蘆筍性別調(diào)控機(jī)理,將為促進(jìn)兩性花形成和豐富蘆筍資源材料奠定基礎(chǔ)。

已有研究表明,碳氮比與植物花芽性別分化相關(guān)[7-8]。碳氮化合物是植物花芽分化過程中重要的營養(yǎng)物質(zhì)。20世紀(jì)初提出的碳氮比學(xué)說認(rèn)為碳氮比對控制花芽分化起著重要作用[9]。在希爾核桃中,發(fā)現(xiàn)N的缺乏會加劇雌花敗育,并且雌花敗育時,2年生核桃枝條木質(zhì)部中的氮和淀粉含量降低到最低點[10]。張建銘等[11]研究大花梔子花芽分化過程中碳氮比的變化,發(fā)現(xiàn)在花芽孕育期碳氮比急劇升高,推測碳氮比對于花芽孕育起著主要的作用。為探明蘆筍兩性花、雄花發(fā)育與碳氮化合物的關(guān)系,本研究比較分析了蘆筍兩性花與雄花不同發(fā)育階段碳氮化合物含量及相關(guān)基因表達(dá)水平的動態(tài)變化,將有助于揭示蘆筍兩性花與雄花發(fā)育的調(diào)控機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以蘆筍品種冠軍為試驗材料,并將其種植于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所試驗基地。在2016-2018年春季蘆筍現(xiàn)蕾期-開花期進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。在蘆筍盛花期分別挑取20株正常生長且生長較一致的兩性株和雄株,按照花蕾從小到大分為(0.7±0.1)mm，(1.5±0.1)mm，(2.0±0.1)mm，(3.5±0.1)mm共4個級別,在Leica S8APO體式顯微鏡下對其形態(tài)特征進(jìn)行觀察比較,每級觀察30個花蕾。花蕾從植株上摘下后,立即觀察,將花蕾一半的花瓣剝離,置于體式顯微鏡下觀察拍照,對比同一時期的兩性花、雄花花蕾的形態(tài)差異,具兩性花特點并且后期結(jié)出果實的雄性雌型株標(biāo)記為兩性株。

1.2 碳氮化合物的測定

分別取兩性株、雄株發(fā)育至性別分化與性別決定的前期(花蕾長度(0.7±0.1)mm)、中期(花蕾長度(1.5±0.1)mm)、后期(花蕾長度(2.0±0.1)mm)3個時期的花蕾2 g。樣品烘干后研磨粉碎至0.15 mm,采用島津NC-80型全自動碳氮分析儀測定兩性花蕾與雄花蕾的碳、氮化合物總含量。

1.3 RNA 提取、文庫構(gòu)建和測序

分別提取兩性花、雄花3個時期的花蕾總RNA。采用TRIzol(購于Invitrogen 公司)進(jìn)行總RNA的提取。依據(jù)兩性花、雄花發(fā)育時期的先后順序,將各時期RNA 池分別標(biāo)記為H1、H2、H3、M1、M2、M3。RNA-Seq測序由深圳華大基因研究院完成,采用 Hi Seq X10 測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

1.4.1 可變剪接事件鑒定 從蘆筍基因組數(shù)據(jù)庫下載蘆筍全基因組序列及其注釋文件(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/genome/?term=Asparagus+officinalis+L.)。采用軟件HISAT2將RNA-seq測序得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)序列與蘆筍基因組進(jìn)行序列比對,使用rMATs軟件對樣品中可變剪接事件進(jìn)行分類和統(tǒng)計。主要的可變剪接事件有5種:外顯子跳躍、內(nèi)含子滯留、5′端可變剪切位點、3′端可變剪切位點、互斥外顯子。

1.4.2 發(fā)生可變剪接基因的功能注釋及富集分析 對于雄花與兩性花各發(fā)育時期中發(fā)生可變剪接的基因,本研究采用rMATS軟件分析了各樣本中共有及特有的可變剪接基因數(shù)量。應(yīng)用TermFinder軟件,獲得包括生物學(xué)過程(Biological process)、分子功能(Molecular function)和細(xì)胞構(gòu)成(Cellular component)等類別的GO 注釋編號。利用在線工具(http://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/gogsea)進(jìn)行功能富集分析,統(tǒng)計每個GO類別中基因與背景基因間的差異,并對P值進(jìn)行校正。定義校正后的P≤0.05為該基因集在此GO項中顯著富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆筍兩性花、雄花形態(tài)差異的分析

利用體式顯微鏡觀察蘆筍兩性花、雄花的4個不同發(fā)育時期(花蕾長度分別為(0.7±0.1)mm，(1.5±0.1)mm，(2.0±0.1)mm，(3.5±0.1)mm)的形態(tài)特征(圖1),顯示了由兩性花向單性花發(fā)育的動態(tài)變化過程。蘆筍兩性花、雄性花蕾在發(fā)育前期(0.7±0.1)mm的花器官中均既有雄蕊又有心皮。當(dāng)花蕾發(fā)育至1.5 mm時,兩性花中雌蕊花柱開始發(fā)育,出現(xiàn)了明顯的花柱和柱頭,而雄花中未見花柱及柱頭。當(dāng)花蕾發(fā)育至2.0 mm時,兩性花的雄蕊繼續(xù)發(fā)育,花絲伸長,子房繼續(xù)膨大,分化出花柱并伸長,形成明顯的柱頭；而雄花中雄蕊繼續(xù)發(fā)育,花絲伸長,花柱和柱頭發(fā)育受阻,不形成花柱和柱頭。當(dāng)花蕾發(fā)育至3.5 mm時,兩性花已發(fā)育完全,有發(fā)育良好的雄蕊、子房、花柱和柱頭；而雄花中雄蕊發(fā)育良好,子房發(fā)育停滯,不形成花柱和柱頭。Caporali等[12]利用電子顯微鏡觀察比較了蘆筍不同發(fā)育時期的雌、雄花形態(tài),發(fā)現(xiàn)蘆筍花蕾由兩性花向單性花轉(zhuǎn)變時的形態(tài)特點是花柱開始發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)花蕾長度約1.5 mm時為兩性花的花柱開始發(fā)育,表明花蕾長度為1.5 mm時,是兩性花向單性花轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時期。

2.2 蘆筍兩性花、雄花碳氮化合物含量的差異分析

通過測定蘆筍兩性花與雄花在性別分化的前期、中期、后期3個時期花蕾中碳氮化合物含量(表1),發(fā)現(xiàn)在性別分化的前期、中期,兩性花蕾中碳含量均低于雄花蕾,但差異不顯著,氮含量顯著高于雄花蕾,特別是在性別分化中期的差異較大；在性別分化后期,兩性花蕾中碳含量與雄花蕾相當(dāng),但氮含量仍然顯著高于雄花蕾。在蘆筍兩性花發(fā)育的整個過程中C/N比值始終低于雄花,并且在性別分化的中期、后期差異達(dá)到顯著水平?？梢?兩性花中雌蕊的發(fā)育需要較高的氮素,即較低的C/N比值有利于雌蕊的發(fā)育。兩性花中碳含量隨著花發(fā)育先降低后升高,雄花中碳含量的變化趨勢與兩性花中一致。兩性花中氮含量隨著花發(fā)育逐漸降低,雄花中氮含量先降低后略有升高。

表1 蘆筍兩性花與雄花不同發(fā)育時期碳氮化合物含量的變化Tab.1 The dynamics of the carbon and nitrogen compound content in hermaphroditic flowers and male flowers of asparagus at different developmental stages

注:時期Ⅰ為花蕾發(fā)育至0.7 mm;時期Ⅱ為花蕾發(fā)育至1.5 mm;時期Ⅲ為花蕾發(fā)育至2.0 mm。H.兩性花;M.雄花。表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,采用T檢驗法檢驗了數(shù)據(jù)顯著性(P<0.05),同一發(fā)育時期相同指標(biāo)不同小寫字母表示兩性花與雄花差異顯著。

Note:Stage I represents the flower bud development to 0.7 mm; Stage Ⅱrepresents the flower bud development to 1.5 mm; Stage Ⅲ represents the flower bud development to 2.0 mm. H. The hermaphroditic flower; M. The male flower. The data in the table are average±standard deviation, the significance of the data is tested byT-test(P<0.05). Different lowercase letter represents significant difference between the hermaphroditic flower and male flower in the some index at the same stage.

2.3 蘆筍兩性花、雄花氮化合物相關(guān)基因可變剪接事件的差異分析

為了解蘆筍兩性花、雄花中發(fā)生可變剪接基因的功能,對所有發(fā)生可變剪接的基因進(jìn)行了GO分析。結(jié)果表明,蘆筍兩性花與雄花相比,其特有可變剪接基因顯著富集到細(xì)胞氮化合物代謝過程、有機(jī)氮化合物代謝過程和細(xì)胞氮化合物生物合成過程等5條氮化合物代謝相關(guān)的GO條目中,共包含相關(guān)基因86個(表2),而雄花特有可變剪接基因在此GO條目中沒有富集,反映了氮化合物代謝相關(guān)的GO條目與蘆筍兩性花發(fā)育的關(guān)系十分緊密。

表2 蘆筍兩性花特有可變剪接基因中氮化合物代謝相關(guān)基因的GO分類信息Tab.2 GO classification information of nitrogen compound related genes only in alternative splicing genes specific to asparagus hermaphroditic flower

找到蘆筍兩性花特有的可變剪接基因中86個氮化合物代謝相關(guān)基因在蘆筍參考基因組上的注釋信息(表3),發(fā)現(xiàn)它們主要為編碼核糖體蛋白基因、MADS-box轉(zhuǎn)錄因子和一些酶類物質(zhì)等,其中以編碼核糖體蛋白基因數(shù)量最多。表明,蘆筍兩性花的形成與核糖體蛋白基因、MADS-box轉(zhuǎn)錄因子和一些酶類物質(zhì)等氮化合物代謝相關(guān)。

表3 蘆筍兩性花特有可變剪接基因中氮化合物代謝相關(guān)基因的注釋信息Tab.3 The annotation information of nitrogen compound related genes in alternative splicing genes specific to asparagus hermaphroditic flowers

表3(續(xù))

蘆筍兩性花特有可變剪接基因中86個氮化合物代謝相關(guān)基因在3個發(fā)育時期均發(fā)生了可變剪接事件,并且3個發(fā)育時期內(nèi)共發(fā)生了374個可變剪接事件(表4)。進(jìn)一步反映了可變剪接與氮化合物合成相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系非常密切。這些基因發(fā)生可變剪接的類型主要有5種,其中以A3SS類型最多,A5SS次之,MXE最少。并且在不同的發(fā)育時期,大多數(shù)基因發(fā)生可變剪接事件的類型和次數(shù)存在差異。86個基因發(fā)生可變剪接事件的時間主要在兩性花性別分化前期,該時期中發(fā)生了2次及以上可變剪接的基因有37個,而在兩性花性別分化的中期和后期分別有29,30個。這些剪接事件在雄花中并未檢測到,說明氮化合物代謝相關(guān)基因可能與兩性花的形成相關(guān)?；虬l(fā)生可變剪接以后可能引起其編碼蛋白的含量及功能改變,這一結(jié)論正好與前面試驗中檢測到蘆筍兩性花與雄花蕾中氮化合物含量存在差異相吻合。

2.4 蘆筍兩性花發(fā)生特有可變剪接的氮化合物相關(guān)基因表達(dá)分析

依據(jù)FPKM值,進(jìn)一步分析了上述氮化合物代謝相關(guān)基因在蘆筍兩性花與雄花中的表達(dá)情況(圖2)。結(jié)果表明,在蘆筍兩性花與雄花的不同發(fā)育時期這86個氮化合物代謝相關(guān)基因的表達(dá)量均存在差異。與雄花蕾相比,在兩性花性別分化的前期、中期,分別有52,47個氮化合物代謝相關(guān)基因高表達(dá)；而在兩性花性別分化后期,略高于雄花蕾的氮化合物代謝相關(guān)基因只有38個。這與兩性花蕾中含氮量高于雄花蕾的差異一致。說明在性別分化的前期、中期,兩性花蕾中氮化合物代謝相關(guān)基因的高表達(dá),可能引起了氮化合物含量的增加。這進(jìn)一步表明蘆筍兩性花與雄花中氮化合物代謝相關(guān)基因的差異表達(dá)可能是引起它們性別分化差異的重要因素。

表4 蘆筍兩性花特有可變剪接基因中氮化合物代謝相關(guān)基因的可變剪接類型Tab.4 The alternative splicing types of nitrogen compound related genes in alternative splicing genes specific to asparagus hermaphroditic flowers

注:A3SS.3′端可變剪切位點； ES.外顯子跳躍； IR.內(nèi)含子滯留；A5SS.5′端可變剪切位點； MXE.外顯子互斥。

Note:A3SS.Alternative 3′ splice site；ES.Exon skipping；IR.Intron retention；A5SS.Alternative 5′ splice site；MXE.Mutually exclusive exon.

圖2 蘆筍兩性花、雄花蕾中氮化合物相關(guān)基因的表達(dá)量差異Fig.2 Expression differences of nitrogen compound related genes in the hermaphroditic and male flower buds

此外,在蘆筍兩性花發(fā)育進(jìn)程中,86個氮化合物代謝相關(guān)基因中有67個基因表達(dá)量在性別分化中期低于性別分化前期,有44個基因表達(dá)量在性別分化后期低于性別分化中期,這與兩性花中氮化合物含量逐漸降低的變化趨勢一致。在蘆筍雄花由性別分化前期到中期的過程中,有56個基因表達(dá)量降低；在性別分化中期到后期的過程中,有34個基因表達(dá)量降低,31個基因表達(dá)量略有升高,這與雄花中氮化合物含量先降低后略升高的變化趨勢一致。

3 討論

在眾多的植物花芽分化研究理論中,碳氮比理論認(rèn)為碳氮比對植物花性別的分化有較大的影響[8,11]。肖華山等[7]發(fā)現(xiàn)荔枝花中較小的C/N比值和較高的氨基酸含量有利于雌蕊分化。李利紅等[13]發(fā)現(xiàn)杏花雌蕊發(fā)育較好則其氨基酸含量也較高。本研究測定了兩性花與雄花在性別分化的前期、中期、后期3個時期花蕾中碳氮化合物含量,發(fā)現(xiàn)在3個發(fā)育時期,兩性花蕾中含氮量一直高于雄花蕾,且在性別分化中期差異達(dá)到最大。在性別分化前期、中期,兩性花蕾中含碳量低于雄花蕾；在性別分化后期,含碳量與雄花蕾相當(dāng)?？梢?較小的C/N比值有利于蘆筍兩性花雌蕊的分化。

已有研究表明,蘆筍性別是由雌性抑制基因(SOFF)和雄性特異基因(aspTDF1)構(gòu)成的“雙基因座模型”調(diào)控[14-15],除了這2個性別決定基因以外,有研究者認(rèn)為在蘆筍兩性花中還存在一些性別修飾基因[16],這些基因受環(huán)境因子的影響[17]。同一兩性單株在不同年份不同季節(jié)開的花,其發(fā)育程度、結(jié)實性也存在一定的差異[5]。這些現(xiàn)象說明環(huán)境條件影響了與兩性花中性別修飾基因的表達(dá)?？勺兗艚幽軌蛲ㄟ^調(diào)節(jié)基因的表達(dá),造成蛋白質(zhì)組多樣性,從而對植物生長發(fā)育起著重要的作用[18]。本研究分析了蘆筍兩性花與雄花3個發(fā)育時期中基因的可變剪接,發(fā)現(xiàn)有86個氮化合物相關(guān)基因只在兩性花中發(fā)生了可變剪接,這些基因編碼核糖體蛋白、MADS-box轉(zhuǎn)錄因子和一些酶類物質(zhì)等。核糖體是遺傳物質(zhì)翻譯、合成蛋白質(zhì)的場所。在荔枝雄花雌蕊原基的衰敗過程中首先是核糖體降解[19]。核糖體蛋白是組成核糖體的主要成分,在植物胚胎發(fā)育、花器官發(fā)育尤其是雌配子體發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用[20]。MADS-box基因也在植物花性別分化、花器官發(fā)育方面起著重要作用[21-23]。由此可見,蘆筍兩性花的性別分化、雄花的性別決定與核糖體蛋白基因、MADS-box轉(zhuǎn)錄因子等氮化合物基因相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在兩性花性別分化的前期、中期,分別有52,47個氮化合物代謝相關(guān)基因高表達(dá),而在雄花中低表達(dá)。在兩性花性別分化后期,有38個氮化合物代謝相關(guān)基因表達(dá)量略高于雄花蕾。這與兩性花蕾中含氮量高于雄花蕾的差異一致。劉孟等[24]也發(fā)現(xiàn)蘆筍雌花發(fā)育過程中氮化合物多胺含量高于雄花,并認(rèn)為高水平多胺與蘆筍雌性器官發(fā)育相關(guān)。這進(jìn)一步表明氮化合物與蘆筍兩性花、雄花的發(fā)育密切相關(guān)。但含氮化合物相關(guān)基因調(diào)控兩性花發(fā)育的機(jī)理還有待深入研究。

綜上所述,蘆筍兩性花中性別決定基因可能直接或間接的調(diào)控了氮化合物代謝相關(guān)基因的表達(dá),一方面通過可變剪接調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的多樣性,另一方面通過改變相關(guān)基因的表達(dá)量,這些調(diào)控機(jī)制造成了兩性花中氮化合物含量高于雄花,最終使得兩性花與雄花的形態(tài)結(jié)構(gòu)不同。研究結(jié)果不但揭示了蘆筍兩性花與雄花發(fā)育調(diào)控機(jī)制的差異,更為人為調(diào)控兩性花的形成提供了理論依據(jù)。