應用計算機模擬研究牛膝在骨關節(jié)炎中的痿痹同治作用

鄭春松，葉蕻芝，葉錦霞，付長龍*

1 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建 福州350122；

2 福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州350122

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是中老年常見的慢性退行性骨關節(jié)疾病，其主要病理特點為關節(jié)軟骨的退變性病變和繼發(fā)性的骨質增生，屬于中醫(yī)“骨痹”“膝痹”的范疇［1］。 本課題組前期基于陳可冀學術思想之OA 研究，認為OA 中的關節(jié)軟骨退變臨床表現(xiàn)為“痿”，骨質增生臨床表現(xiàn)為“痹”，提出了OA 的核心病機為本痿標痹，揭示了痿痹同治在OA 治療中的重要意義［2］。 因此，開展痿痹同治的中藥研究成為熱點。

牛膝作為治療OA 常用方藥獨活寄生湯的重要組成中藥［3］，在《神農本草經(jīng)》中被列為上品，既能活血祛瘀，又能補益肝腎，強筋壯骨，兼能祛風濕，用于治療腰膝酸痛和下肢痿軟［4］。臨床試驗表明，牛膝醇提物離子導入治療膝骨關節(jié)炎，取得很好療效［5］。現(xiàn)代研究表明，牛膝醇提物能刺激軟骨細胞增殖，增加軟骨中Ⅱ型膠原表達，恢復軟骨基質成分，穩(wěn)定潮線結構，改善關節(jié)粘連，修復軟骨損傷［6］，提示牛膝具有治痿的作用。 此外，牛膝正丁醇提取部位具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用［7］，提示牛膝存在治痹的作用。 但是，有關牛膝治痿和治痹的活性成分和作用靶點未見報道。因此，本文以OA 的核心病機本痿標痹為切入點，利用計算機模擬方法［8-10］，從分子水平探討牛膝痿痹同治的藥效物質基礎、作用靶點及作用方式，揭示其在OA 中痿痹同治的作用，為其治療OA 的臨床應用和新藥開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

牛膝化學成分和治痿、治痹藥物分子數(shù)據(jù)集；OA 治痿和治痹相關靶點。

1.2 研究工具

本研究基于Windows 系統(tǒng)的計算模擬與數(shù)據(jù)建模平臺Discovery StudioTM（簡稱DS）完成相關計算。 計算過程中除非特別說明，所選用的參數(shù)均為缺省值。 所有計算工作皆在北京大學化學與分子工程學院計算機模擬實驗室完成。

1.3 方法

1.3.1 牛膝化學成分和治痿、治痹藥物的分子數(shù)據(jù)集建立 從中國知網(wǎng)和PubMed 等數(shù)據(jù)庫中，檢索牛膝的化學成分73 個［11-14］；從DrugBank 數(shù)據(jù)庫中搜索與OA 治療相關的藥物31 個，其中，主要作用為刺激關節(jié)軟骨中蛋白多糖合成的藥物3 個，以及抗炎鎮(zhèn)痛的藥物28 個，見表1。 在DS 模擬平臺上，搭建三維分子結構，用Merck Molecular Force Field（MMFF）力場優(yōu)化，建立牛膝化學成分和治痿、治痹藥物的分子數(shù)據(jù)集［15］。

表1 治痿和治痹的藥物信息Table 1 The drugs information of treating Wei syndrome and Bi syndrome

1.3.2 牛膝化學成分在治痿、治痹藥物分子的化學空間分布 在DS QSAR 模塊下，選擇碳原子數(shù)、氧原子數(shù)、氮原子數(shù)、分子量、氫鍵受體數(shù)目、氫鍵給體數(shù)目、脂水分配系數(shù)、可旋轉鍵數(shù)目和環(huán)數(shù)目等描述符48 個［16］，來計算治痿和治痹藥物分子數(shù)據(jù)集的多維描述符值，此多維空間分別定義為治痿和治痹藥物分子的化學空間［17］。 同時，按上述方法，建立牛膝化學成分數(shù)據(jù)集的化學空間。 利用主成分分析（principal component analysis，PCA）［18］，將上述數(shù)據(jù)集的描述符多維數(shù)據(jù)有效映射到三維化學空間上，分析牛膝化學成分與治痿、治痹藥物分子的分子數(shù)據(jù)集化學空間的異同。

1.3.3 牛膝中治痿和治痹化合物-靶點網(wǎng)絡的構建與分析 根據(jù)治療靶數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database）［19］和相關文獻［20-21］，確定與治痹直接 相 關IL-1β、IL-6、TNF-α，以及治痿直接相關MMP-1、MMP-3、TGF-β1 為靶點，在RCSB Protein Data Bank上［22］，分別下載其結構（表2）。 在DS 模擬平臺中［23］，蛋白結構去溶劑、去配體、加氫處理后，以其所含的活性原配體來確定活性位點； 在DS Ligand-Fit 模塊中［24］，使用蒙特卡羅方法對牛膝化學成分數(shù)據(jù)集進行構象采樣、Dreiding 力場下進行打分，保留DOCK-SCORE 最高的構象。 以各自原配體DOCKSCORE 為閾值，篩選牛膝中治痿和治痹的潛在活性化合物。 將牛膝中活性化合物及其作用靶點視為節(jié)點，兩者的相互作用用邊表示。 采用Cytoscape軟件［25］，構建牛膝的治痿化合物-靶點網(wǎng)絡和治痹化合物-靶點網(wǎng)絡，并在此軟件的Network Analysis 模塊下，分析牛膝中化合物與靶點作用情況。

表2 治療骨關節(jié)炎的重要靶點Table 2 The important therapeutic targets of osteoarthritis

2 結 果

2.1 牛膝的化學空間特征

牛膝化學成分分子數(shù)據(jù)集在分子量、氫鍵受體數(shù)目、氫鍵給體數(shù)目和脂水分配系數(shù)等重要描述符值的分布范圍均比治痿藥物分子數(shù)據(jù)集、治痹藥物分子數(shù)據(jù)集廣，見表3、表4。 牛膝化學成分與藥物數(shù)據(jù)集的化學空間（見圖1）顯示，相對于治痿和治痹的藥物數(shù)據(jù)集，牛膝化學成分分子數(shù)據(jù)集在化學空間上具有更好的分散性，且在后方存在與治痿藥物分子數(shù)據(jù)集相似或相近的化學空間，在底部存在與治痹藥物數(shù)據(jù)集相似或相近的化學空間。

表3 牛膝化學成分分子數(shù)據(jù)集和治痿藥物分子數(shù)據(jù)集的一些物理化學屬性Table 3 Some physicochemical properties of chemical components dataset of Niuxi and drug dataset of treating Wei syndrome

表4 牛膝化學成分分子數(shù)據(jù)集和治痹藥物分子數(shù)據(jù)集的一些物理化學屬性Table 4 Some physicochemical properties of chemical components dataset of Niuxi and drug dataset of treating Bi syndrome

2.2 牛膝中治痿和治痹化合物-靶點網(wǎng)絡

以表2 的蛋白為治療OA 的虛擬藥理篩選模型，建立了牛膝的治痿化合物-靶點網(wǎng)絡（見圖2）和治痹化合物-靶點網(wǎng)絡（見圖3），結果顯示了牛膝的藥效物質基礎主要為皂苷類、 植物甾酮類、黃酮類和生物堿化合物等，且治痿和治痹的化合物個數(shù)分別為26 和37 個，其中，同時具有治痹和治痿作用化合物個數(shù)為20 個，且能作用的靶點數(shù)最大數(shù)達到6 個。表5 顯示，牛膝中治痿化合物-靶點網(wǎng)絡中重要化合物節(jié)點為黃芩苷，即牛膝中治痿的重要活性物質為黃酮類化合物，以及其重要靶點節(jié)點為MMP-1；表6 顯示，牛膝中治痹化合物-靶點網(wǎng)絡中重要化合物節(jié)點為葛根素、黃芩苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖苷，即牛膝中治痹的重要活性物質為黃酮類化合物， 以及其重要靶點節(jié)點為IL-1β 和TNF-α。

圖1 牛膝化學成分與藥物數(shù)據(jù)集的化學空間分布Figure 1 The distribution of chemical components dataset of Niuxi and drug datasets in chemical space

圖2 牛膝中治痿化合物-靶點網(wǎng)絡Figure 2 The compound-target network of Niuxi in treating Wei syndrome

表5 牛膝中治痿化合物-靶點網(wǎng)絡的重要節(jié)點信息Table 5 Key nodes information of the compound-target network of Niuxi in treating Wei syndrome

圖3 牛膝中治痹化合物-靶點網(wǎng)絡Figure 3 The compound-target network of Niuxi in treating Bi syndrome

3 討 論

3.1 牛膝痿痹同治的研究意義

OA 治療的目的主要有2 個方面：①緩解關節(jié)疼痛；②改善功能并重建受損的軟骨及骨的結構［20］。前者主要是中醫(yī)治痹的作用，常用非甾體類抗炎藥，減輕疼痛，但長期使用存在胃腸不良反應［26］；后者主要是中醫(yī)治痿的作用，常用氨基葡萄糖和硫酸軟骨素等，保護關節(jié)軟骨，但真正能夠達到改善功能并重建受損的軟骨和骨的結構的可靠藥物還不多［27］。在OA 的不同階段，痹與痿是可以轉化、并存的［28］，這提示單用具有治痿或治痹的藥物可能對OA 病情起不到很好的改善效果；中醫(yī)藥治療OA 有著悠久的歷史，且發(fā)揮出獨特的優(yōu)勢、副作用少，特別是具有多組分、多靶點作用的中藥，是藥物開發(fā)和研究的寶藏［29-30］。 在治療OA 的中藥中，牛膝的使用頻率最高［31］。 《神農本草經(jīng)》中有關牛膝的記載：“主寒濕痿痹，四肢拘攣，膝痛不可曲伸……”［4］，提示其具有痿痹同治的作用。 因此，從牛膝中發(fā)現(xiàn)痿痹同治的多靶點藥物，有望成為治療OA 的新方向。

表6 牛膝中治痹化合物-靶點網(wǎng)絡的重要節(jié)點信息Table 6 Key nodes information of the compound-target network of Niuxi in treating Bi syndrome

3.2 痿痹同治藥物發(fā)現(xiàn)的研究靶點選擇

痿痹同治藥物發(fā)現(xiàn)的基礎是尋找分子靶點。 一方面，從OA 疼痛入手，OA 炎性疼痛主要是炎癥細胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α 等）誘導的炎癥引起的。隨著疾病的進程，炎癥細胞因子（IL-1β、IL-6、TNFα 等）長時間刺激骨關節(jié)周圍的末梢神經(jīng)，可致OA神經(jīng)病理性疼痛［21，32］。由此將IL-1β、IL-6 和TNF-α作為治痹的分子靶點。 另一方面，從軟骨退化與軟骨修復入手，MMPs 是一類與軟骨Ⅱ型膠原的降解密切相關的關鍵酶［33-34］，其中，MMP-1 的過表達導致軟骨Ⅱ型膠原的降解是軟骨退變的重要原因，且MMP-3 可通過對間質膠原酶的激活來實現(xiàn)對軟骨Ⅱ型膠原的降解，進一步加速軟骨的破壞；TGF-β1是目前發(fā)現(xiàn)的最強細胞促生長因子，具有促進軟骨細胞的增殖與分化、促進軟骨基質的合成、以及修復軟骨等功能，并能通過抑制MMPs 的合成來降低軟骨基質的降解，在軟骨的生長和重建中起著關鍵性作用［35］。因此，本研究將IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-3 和TGF-β1 作為從中藥中痿痹同治藥物發(fā)現(xiàn)的研究靶點。

3.3 牛膝痿痹同治藥效物質基礎和作用靶點分析

圖1 化學空間結果顯示牛膝化學成分的化學空間具有很好的分散性，且與治痿、治痹藥物的化學空間有較好的重疊或距離很近，依據(jù)定量構效關系理論［17］，提示牛膝具有廣譜的作用，可能存在治痿、治痹的活性物質，因此，構建牛膝治痿和治痹化合物-靶點網(wǎng)絡，來研究牛膝痿痹同治的藥效物質基礎和作用靶點。

牛膝中治痿化合物-靶點網(wǎng)絡顯示了牛膝中26個化合物節(jié)點，涵蓋了皂苷類（如節(jié)點34，牛膝皂苷A）、植物甾酮類（如節(jié)點44，蛻皮甾酮）、黃酮類（如節(jié)點61，黃芩苷）、生物堿（如節(jié)點64，黃連堿）、甾醇類（如節(jié)點1，β-谷甾醇）、醌類（如節(jié)點47，大黃酚）和環(huán)烯醚萜苷類（如節(jié)點66，京尼平苷）；牛膝中治痹化合物-靶點網(wǎng)絡顯示了牛膝中37 個化合物節(jié)點，涵蓋了皂苷類（如節(jié)點34，牛膝皂苷A）、植物甾酮類（如節(jié)點44，蛻皮甾酮）、黃酮類（如節(jié)點61，黃芩苷）、生物堿（如節(jié)點63，巴馬亭）、甾醇類（如節(jié)點40，α-菠甾醇）、肽類［如節(jié)點72，環(huán)（酪氨酸-亮氨酸）］和環(huán)烯醚萜苷類（如節(jié)點66，京尼平苷）。 上述顯示了牛膝中治痹比治痿存在更多的活性物質，提示牛膝的作用可能偏治痹，為牛膝歸屬于“活血化瘀藥”提供了新依據(jù)；另外，治痿和治痹存在部分相同的化學物質，如皂苷類、植物甾酮類、黃酮類等，其中，實驗已經(jīng)證實了牛膝總皂苷具有治痿和治痹的作用［36-37］。鑒于牛膝醇提物中含有皂苷類、植物甾酮類、黃酮類等，上述也為牛膝醇提物離子導入治療OA 提供了實驗依據(jù)。而且，本文計算了網(wǎng)絡節(jié)點的度和介數(shù)，用來評價化合物和靶點在網(wǎng)絡中的重要性［38］。 表5、6 顯示牛膝治痹的主要靶點和化合物分別為MMP-1 和黃芩苷，治痿的主要靶點和化合物分別為IL-1β、TNF-α 和葛根素，提示牛膝痿痹同治的關鍵作用靶點為MMP-1、IL-1β 和TNF-α，以及關鍵藥效物質基礎為黃酮類化合物，為后期牛膝痿痹同治實驗研究提供方向。

3.4 牛膝痿痹同治的作用方式分析

從化合物-靶點網(wǎng)絡可以看出，牛膝痿痹同治的作用方式可能有兩種：第1 種是單個化合物同時作用于治痿和治痹靶點，即混雜藥物［39］，如節(jié)點61（黃芩苷）能作用于IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-3和TGF-β1；第2 種是多種化合物組合作用于治痿和治痹靶點，即組合藥物［39］，如節(jié)點44（蛻皮甾酮）能作用于MMP-1，節(jié)點13（阿魏酸）能作用于IL-6，兩者組合可起到痿痹同治的作用。 上述為從牛膝中發(fā)現(xiàn)治療OA 痿痹同治的多靶點藥物和治療新策略提供了依據(jù)，有助于牛膝的進一步開發(fā)利用。

4 小 結

本研究開展牛膝在OA 中痿痹同治作用的計算機模擬，分析了其藥效物質基礎、作用靶點及作用方式，直觀揭示了牛膝治療骨關節(jié)炎可能是通過類似混雜藥物和組合藥物的方式達到痿痹同治的多靶點作用。 在此基礎上，課題組下一步將以改良Hulth造模法復制膝OA 和IL-1β 誘導的退變關節(jié)軟骨細胞為模型［40-41］，以MMP-1、IL-1β 和TNF-α 為主要檢測指標，進行“牛膝-黃酮有效部位-有效成分”的系統(tǒng)層次研究，驗證模擬出來的潛在活性物質，最終創(chuàng)制痿痹同治的多靶點新藥，進一步凸顯牛膝在治療OA 中的重要性。