光合微生物混菌體系的應用和研究進展

張麗，宋馨宇,4，陳磊，張衛(wèi)文,4

·綜 述·

光合微生物混菌體系的應用和研究進展

張麗1,2,3，宋馨宇1,2,3,4，陳磊1,2,3，張衛(wèi)文1,2,3,4

1 天津大學 化工學院合成微生物學實驗室，天津 300072 2 教育部合成生物學前沿研究中心，天津 300072 3 教育部系統(tǒng)生物工程重點實驗室，天津 300072 4 天津大學 生物安全戰(zhàn)略研究中心，天津 300072

光合微生物與其他異養(yǎng)微生物混菌共培養(yǎng)是近年來的研究熱點，該體系彌補了光合微生物純培養(yǎng)時易染菌、不穩(wěn)定等缺陷，在污水處理、土壤改善、生物降解有害物質(zhì)、生產(chǎn)高附加值產(chǎn)物方面擁有廣闊的應用前景。文中通過系統(tǒng)總結天然和人工光合微生物混菌體系的研究進展，探究人工構建的光驅動混菌體系的基礎理論和應用前景，為進一步利用合成生物學等前沿技術理性改造基于光合微生物的混菌培養(yǎng)系統(tǒng)提供科學依據(jù)。

光合微生物，混菌體系，環(huán)境工程，細胞工廠，相互作用

光合微生物是一類能夠利用太陽能和二氧化碳作為唯一能源和碳源，進行自養(yǎng)營養(yǎng)生長的生物。光合微生物與其他異養(yǎng)菌形成的混菌體系在自然界中普遍存在，例如人們熟悉的地衣，即為這一類體系的典型代表。在地衣中，光合微生物利用太陽光進行光合作用合成有機物，為真菌生長繁殖提供所需的碳源，而真菌能向光合微生物提供生長因子和運輸無機營養(yǎng)，同時還能對光合微生物起到保護作用[1]。

光合微生物與異養(yǎng)菌之間相互關系的存在可增強混菌體系成員響應和適應環(huán)境的能力，從而更好地在自然界中生存下去[2-4]。仍舊以地衣為例，這種常見的自然混菌體系有著極強的適應能力與抗逆性，能夠作為先鋒生物在高山帶、凍土帶和南北極地區(qū)等極端條件下生存，且共存時間很長，有的壽命甚至可達千年[5-6]。除此之外，還有像缺乏維生素B12相關代謝途徑的萊茵衣藻與可產(chǎn)維生素B12相關的異養(yǎng)菌共存、慢生根瘤菌與固氮螺菌的共存等[7-8]。更值得關注的是，光合微生物混菌體系還有改善生態(tài)環(huán)境的功能，比如污水的凈化、水體污染物的降解以及促進農(nóng)藥降解等諸多生態(tài)學意義[9-11]。自然環(huán)境的污水中存在大量的異養(yǎng)微生物群落，藻類的光合作用和異養(yǎng)菌的代謝及呼吸作用能協(xié)同降解污水中的有機物，并能實現(xiàn)同步脫氮除磷及抗生素、重金屬的去除。Loutseti等[12]利用菌藻混菌系統(tǒng)處理銅、鈣污水，離子去除效率分別達到80%和100%；隨后，Bai 和Achary[13]采用菌藻混菌系統(tǒng)處理磺胺甲惡唑、三氯生污水，處理效率分別達到32%和74%。很多研究還證實，光合微生物和土壤中的異養(yǎng)細菌通過建立相互作用，能夠顯著增加農(nóng)作物的微量元素與蛋白質(zhì)的含量，這對植物的生長有著非常重要的作用[14-17]。Naind等[18]將變形桿菌中的普羅威登斯菌sp.與3種藍細菌構建混菌體系混合添加到土壤中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的小麥與普通條件下相比在種質(zhì)上有明顯的改善。這些研究證明光合微生物混菌體系在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中有著重要的價值。因此，對天然存在光合微生物混菌體系的相關理論與應用的研究就顯得尤為重要。

由于經(jīng)過數(shù)億年的進化已經(jīng)適應了特定的生活環(huán)境，天然光合微生物混菌體系在穩(wěn)定性上有一些優(yōu)勢，但是同時也使得其應用的靈活性與廣泛性受到限制。近年來，合成生物學的發(fā)展給混菌系統(tǒng)的應用開辟了新的方向。合成生物學旨在以工程學思想作為指導，通過從頭設計和構建，能夠對現(xiàn)有的和天然的生物系統(tǒng)進行重新設計和改造[19]。美國科學家Ducat等[20]通過向聚球藻PCC 7942中引入蔗糖轉運蛋白基因B并結合系統(tǒng)改造，獲得蔗糖產(chǎn)率高達28 mg/(L·h) 的藍細菌菌株。這個產(chǎn)率足以支持一定的異養(yǎng)菌的生長，因此Ducat等嘗試利用高產(chǎn)蔗糖的. PCC 7942菌株與玻利維亞鹽單胞菌[21]、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等[22]構建人工混菌系統(tǒng)，最終實現(xiàn)了聚羥基丁酸脂 (Polyhydroxybutyrate，PHB)、淀粉酶等多種高附加值物質(zhì)的生產(chǎn)，這一工作也證明了合成生物學技術和策略在混菌系統(tǒng)應用中的價值。

文中將對光合微生物混菌體系的優(yōu)勢、光合微生物混菌體系的應用以及對光合微生物混菌體系機理的解析等方面進行系統(tǒng)的概述，同時還對現(xiàn)階段光合微生物混菌體系存有的問題進行分析與總結，并對光合微生物混菌體系的應用前景作出展望。

1 光合微生物混菌體系的優(yōu)勢

光合微生物混菌體系中不同菌株之間存在相互作用，這是與純培養(yǎng)最本質(zhì)的差別，這種關系的存在使得混菌體系表現(xiàn)出多方面的優(yōu)勢，以下將逐一介紹。

1.1 增加體系的穩(wěn)定性與魯棒性

研究表明，過于劇烈的光波動會對光系統(tǒng)Ⅰ (PSⅠ) 造成損傷[23]，同時，由于不同的光強的變化使得光合微生物本身需要通過一系列的生理調(diào)整來適應生存環(huán)境，其中為了還原由光反應產(chǎn)生的過多氧氣 (O2)，在化學還原O2的同時會生成過氧化氫 (H2O2)，這種活性氧物質(zhì)會嚴重抑制光合微生物自身的生長[24-25]。Ducat等[22]通過將高產(chǎn)糖PCC 7942與W303可利用蔗糖的突變株進行混合培養(yǎng)，該混菌體系在光-暗交替 (16 h光照/8 h黑暗)條件下，雙菌在數(shù)月內(nèi)都可維持生物量的穩(wěn)定。由于酵母的存在可以很好地清除培養(yǎng)基中的活性氧物質(zhì)，因此這種培養(yǎng)模式與其各自菌株的純培養(yǎng)相比，體系的穩(wěn)定性大幅度提高。

1.2 提高生產(chǎn)過程中底物的利用效率

含有淀粉和纖維素的廢棄生物質(zhì)如秸稈等，可用作生物氫 (H2) 生產(chǎn)的廉價原料[26]。通常，傳統(tǒng)的生物氫生產(chǎn)是以含有淀粉的生物質(zhì)作為基底，并利用經(jīng)過熱處理的活性厭氧污泥和梭菌屬和腸桿菌屬的純培養(yǎng)物通過黑暗發(fā)酵進行[27]，由于活性污泥和異養(yǎng)菌在發(fā)酵的過程中會產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸 (VFA) 與二氧化碳 (CO2)，仍舊造成了部分碳源的損失。鑒于此，Kargi等將經(jīng)過熱處理的活性污泥 (Anaerobic sludge，AS) 與光合微生物紅細菌NRRL-B 1727進行混合培養(yǎng)[28-30]。通過在黑暗條件下活性污泥水解生物質(zhì)中的淀粉生成葡萄糖供給污泥中的異養(yǎng)菌和NRRL-B 1727生成VFA，隨后，在光照條件下NRRL-B 1727可利用的VFA進行H2的再生產(chǎn)。該混菌體系在96 h內(nèi)可將底物中的淀粉完全分解成H2與VFA，H2轉化效率為201 mL/g淀粉，最高產(chǎn)率達377 μmol/h，與純異養(yǎng)菌發(fā)酵相比提高了12.9%[31]。

1.3 提升高附加值物質(zhì)的生產(chǎn)能力

萊茵衣藻是一種重要的模式藻類物種，它具有很高的氫化酶活性，加之易于遺傳操作和易培養(yǎng)，已廣泛用于光解介導的H2產(chǎn)生的研究[32-33]。但是氫化酶對氧氣 (O2)非常敏感，在高O2濃度下極易失活。Luo等[34]一項研究中證實，假單胞菌sp.BS4可促進在光介導的條件下生產(chǎn)H2，在BS4-共培養(yǎng)的過程中，體系內(nèi)的O2被異養(yǎng)菌迅速消耗，從而形成一個厭氧環(huán)境，這種環(huán)境被證明非常適合于藻類氫化酶的活化，使之發(fā)揮更好的作用。此外，該研究還證實，BS4的存在能夠減緩微藻葉綠素的消耗，增強微藻的淀粉積累和維持蛋白質(zhì)含量，使得微藻得到更好的生長與H2生產(chǎn)能力。

2 光合微生物混菌體系的應用

由于光合微生物混菌體系具有諸多優(yōu)勢，已在環(huán)境工程、微生物細胞工廠等領域得到廣泛的應用 (表1)。

2.1 環(huán)境工程應用

2.1.1 地表污水處理

大量的工業(yè)生產(chǎn)及人類活動使得地表水中的營養(yǎng)物質(zhì)積累過剩，從而引起嚴重的地表水污染[35]。為避免自然水體的富營養(yǎng)化、保證健康的水生生態(tài)系統(tǒng)，水體中總氮量 (TN) 含量應低于0.3 mg/L，總磷量 (TP) 含量應低于0.02 mg/L[36-39]。傳統(tǒng)的物理化學污水處理方式具有高耗能、高成本、污染物處理不徹底、易形成二次污染等缺陷，生物法處理廢水是近幾年來興起的一種高效清潔的方式，主要利用光合微生物的混菌體系進行 (圖1A–B)。光合微生物可以有效地利用廢水中的氮、磷進行生長，同時產(chǎn)生異養(yǎng)菌所必需的氧氣，體系中的異養(yǎng)菌由此去分解廢水中的有機污染物。根據(jù)此特點，許多微藻和異養(yǎng)菌根據(jù)其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與分解能力在自然界中被分離出來[34,37]。例如，Vyverman等[39]報道了絲狀微囊藻中的剛毛藻、克里藻以及魚腥藻等對氮、磷物質(zhì)具有很高的吸收能力。這些藻類在實驗室條件下 (23 ℃)，氮物質(zhì)的吸收率分別為55.9–70.6 mg NO3–-N/(g DW·d)；磷物質(zhì)的吸收率分別為12.7–27.5 mg PO43–-P/(g DW·d)。除此之外，這些藻類對環(huán)境還有著良好的適應性，在15 ℃至超過35 ℃的溫度下和pH 3–9范圍內(nèi)都可以很好地生長，這極大增加了處理污水的適用性范圍[40-41]，在養(yǎng)殖廢水、河湖水、城市廢水等的凈化中都有很好的應用[42]。

表1 光合微生物混菌體系的應用

2.1.2 土壤修復

自然和人類活動都有可能導致土壤肥力退化和鹽漬化。目前，世界各地約有10億hm2的鹽漬化土地，若將這些鹽堿化土地修復，將會得到極大的土壤資源[43]。傳統(tǒng)的土壤脫鹽方式主要有浸出、去除表面鹽堿層、電場以及其他物理方法等[44]。一般來說，物理方法通常只作用于上層土壤，且在脫鹽的過程中容易導致土壤肥力的降低[45]。一些光合微生物如念珠藻、魚腥藻等在固氮、產(chǎn)生細胞外基質(zhì)和相容溶質(zhì) (通常為胞外多糖物質(zhì)) 上有著突出的能力，這種能力對土壤肥力恢復以及脫鹽漬化有著極其重要的作用[43]。在脫鹽的過程中，光合微生物通常與其他異養(yǎng)微生物共同作用以改善土壤鹽度，這種過程是單一物種所無法完成的，圖1C展示了混菌體系作用于土壤修復的過程?；炀w系工作能力通常由生物量的生長與胞外多糖物質(zhì)的生產(chǎn)能力來表征[43]。高鹽度[46]、高藍光[47]、氮饑餓[48]等條件有利于藍細菌生產(chǎn)胞外多糖物質(zhì)，而異養(yǎng)菌的存在還可以調(diào)節(jié)胞外多糖的分子量、支化度、取代基數(shù)以及超微分子結構等[10]，進而影響胞外多糖的性質(zhì)，使之適用于不同的鹽漬土壤類型。此外，藍細菌還可以與土壤中的細菌、真菌進行復雜的相互作用以此共同改善土壤環(huán)境，提高土壤肥力。Prasanna等[49]首次闡明了細菌和藍細菌菌株之間的積極和動態(tài)相互作用及其在提升小麥等農(nóng)作物產(chǎn)量上的應用前景。研究發(fā)現(xiàn)在額外添加了一種藍藻和兩種異養(yǎng)菌的土壤中所長出的小麥與接種在施加全劑量磷鉀肥料的相比，麥穗重量增加了2倍。此外，土壤微生物學測定中還發(fā)現(xiàn)接種了混菌體系的土壤中脫氫酶、FDA水解酶、堿性磷酸酶的活性以及微生物生物量都有顯著提高。在現(xiàn)場實驗中還發(fā)現(xiàn)，混菌體系應用在土壤中還可以降低40–80 kg N/hm2的氮源成本。Naind等[18]將變形桿菌中的普羅威登斯菌sp.與兩種魚腥藻sp.與眉藻sp.混合添加到土壤，與普通肥料 (N60P60K60) 相比，接種了藍細菌的混菌土壤中長出的小麥麥粒的蛋白質(zhì)含量增加18.6%，F(xiàn)e、Mn和Cu三種微量元素分別增加105.3%、36.7%和150.0%。

圖1 光合微生物混菌體系示意圖

2.1.3 生物降解

金屬離子也會對藻類生物產(chǎn)生毒性，當在其生存環(huán)境中金屬離子較高時，藻類會表現(xiàn)出系統(tǒng)的、特異性的應激反應[50-52]。實驗證明，金屬離子可以被主動攝取進入細胞內(nèi)部進行代謝淬滅，或作為避免細胞中毒的防御工具，微藻在生長的過程中也會釋放一些金屬螯合劑，此外藻類生存環(huán)境的pH值普遍偏高，這也會導致相關重金屬離子的沉淀[53-54]。但通常情況下，單一的光合微生物對金屬離子的耐受性較差，在應用之前需要進行長期的馴化過程，且處理的金屬種類較為單一[55]。有研究證實，許多光合微生物混菌體系可以絡合重金屬離子以及對有機污染物進行降 解[56-57]。因此“藻類-細菌”混菌體系會在金屬離子豐富的環(huán)境中相互排毒和同化金屬，這種機制使得混菌體系在相同條件下可以比單培養(yǎng)體系處理更多種類的金屬離子。此外，Subashchandrabose等報道了混菌體系可以有效降解久效磷、喹硫磷和甲基對硫磷等有機磷殺蟲劑[58]，還發(fā)現(xiàn)混菌體系具有降解多種農(nóng)藥包括DDT、阿特拉津、α-硫丹的功能[54]。Mahdavi與Mu?oz等[53-54,59]發(fā)現(xiàn)光合微生物對有包括黑油、乙腈、苯酚、萘、苯并芘、二苯并呋喃、偶氮化合物等在內(nèi)的有機污染物的處理，利用混菌體系降解酚類物質(zhì)的效率可達100%，然而單獨使用四尾柵藻的降解率只有27%[60]。Tang等[57]報道了一項利用斜生柵藻GH2與4種可以降解不同污染物的異養(yǎng)菌組成的人工混菌體系進行原油降解的研究，該研究可同時降解原油中的多種物質(zhì)。利用該混菌體系進行原油降解時，直鏈烷烴幾乎完全被降解。Ryu等[9]研究中還發(fā)現(xiàn)了光合微生物混菌體能夠降解廢水中的有毒物質(zhì)硫氰酸鹽。

2.2 微生物細胞工廠

2.2.1 脂質(zhì)生產(chǎn)

聚羥基脂肪酸酯 (Polyhydroxyalkanoate，PHA)是目前發(fā)現(xiàn)的在細菌細胞內(nèi)作為碳和能量儲存化合物最豐富的中性脂質(zhì)[61]。用混菌培養(yǎng)方式生產(chǎn)PHA的研究已經(jīng)非常成熟，但研究最多仍為異養(yǎng)菌混菌體系[62-65]。菌藻共混合培養(yǎng)生產(chǎn)PHA由Fradinho等[66]首次提出，該體系對PHA進行生產(chǎn)主要由“富集PHA合成菌株”與“PHA批量合成”兩個階段組成[66]。第一階段使用“飽足-饑餓”模式 (Feast and famine regime)。PHA的積累需要以乙酸作為底物，因此首先使活性污泥中的異養(yǎng)菌在底物乙酸充足的階段積累PHA，底物消耗殆盡之后部分異養(yǎng)菌會為了維持生存開始利用藻類產(chǎn)生的氧氣消耗自身合成的PHA。通過上述模式的往復循環(huán)，能在藻類存在條件下生產(chǎn) PHA的異養(yǎng)菌菌株存活下來，從而達到富集PHA生產(chǎn)菌株的目的。第二階段通過連續(xù)添加底物乙酸來使菌群連續(xù)不斷地產(chǎn)生PHA而不被消耗，達到生產(chǎn)PHA的目的。研究中菌體最高PHA含量為20%，經(jīng)過篩選后的體系，菌藻混菌體系與純異養(yǎng)體系相比具有更高的PHA產(chǎn)量，并且利用菌藻間的相互關系使得體系在長時間內(nèi)可以穩(wěn)定存在，實現(xiàn)PHA的連續(xù)化生產(chǎn)。

2.2.2 多糖生產(chǎn)

微生物的胞外多糖是一種具有廣泛用途的高聚物，例如，β-D-葡聚糖具有免疫調(diào)節(jié)和腫瘤抑制的功能，細菌纖維素可以應用于聲卡膜的制造以及透明質(zhì)酸可以應用于化妝品中等[67]。據(jù)統(tǒng)計，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生胞外多糖的微生物約有 49屬76種[68]。Angelis等[10]報道了一種將微藻、藍細菌和大型真菌共培養(yǎng)的混菌體系用于胞外多糖的生產(chǎn)。該項研究首先基于單一培養(yǎng)體系的生物量和胞外多糖的生產(chǎn)力，篩選出螺旋藻和小球藻兩種光合微生物，以及靈芝、香菇、栓菌、側耳、落葉松蕈5種真菌，并在不同的共培養(yǎng)物中培養(yǎng)。通過13C NMR光譜和氣質(zhì)聯(lián)用對來自單一和混菌體系的水溶性胞外多糖分進行表征與比較，發(fā)現(xiàn)混菌體系生產(chǎn)的胞外多糖的種類與純培養(yǎng)相比有著很大的差別，從分子結構上鑒定出了很多新型多糖。在此基礎上，為了實現(xiàn)多糖的最大生產(chǎn)，Angelis等[10]還對共培養(yǎng)條件，如溫度、攪拌速度、真菌和微藻接種率、初始pH、光照強度和葡萄糖濃度等進行摸索，最終使多糖和生物質(zhì)產(chǎn)量與單培養(yǎng)藍細菌相比分別增加33%和61%。

2.2.3 生物產(chǎn)氫

將混菌體系用于生物產(chǎn)氫已經(jīng)有很多報道。例如，Miura等[69]將萊茵衣藻MGA 161與海洋光合細菌菌株W-1S共培養(yǎng)進行氫氣生產(chǎn)。在此過程中，MGA 161可作為氫光解的電子供體，經(jīng)優(yōu)化后的該體系的氫氣產(chǎn)量可達0.083 μmol/h。Kawaguchi等[70]通過將海紅菌A-501的培養(yǎng)物與淀粉乳桿菌和藻類生物質(zhì)混合將藻類淀粉代謝為乳酸鹽作為電子供體，改善了混菌體系使之更有利于產(chǎn)氫。在混合培養(yǎng)條件下，氫氣的產(chǎn)率較單培養(yǎng)提高1.5倍，產(chǎn)量提高1.4倍，最高產(chǎn)率可達100.75 μmol/h。近年來，Wu等[71-72]將萊茵衣藻與慢生型大豆根瘤菌或圓褐固氮菌進行混合培養(yǎng)生產(chǎn)氫氣，氫氣產(chǎn)率分別達到0.42 μmol/h和0.36 μmol/h，最高已達到萊茵衣藻產(chǎn)氫速率的17倍。同時期，Luo等[33]發(fā)現(xiàn)受污染的菌液中有較高的氫氣積累，并通過一系列的研究證實了受污染菌液中含有的假單胞菌sp. BS4可以促進氫氣的生產(chǎn)，經(jīng)優(yōu)化后的混菌體系氫氣產(chǎn)率可達811 μmol/h。該異養(yǎng)菌除了可協(xié)助萊茵衣藻產(chǎn)氫之外，對小球藻屬、柵藻屬等光合微生物的產(chǎn)氫也有良好的促進作用。

3 光合微生物混菌系統(tǒng)的解析

混菌體系成員之間存在某種相互關系，這種相互關系的存在是與純培養(yǎng)最本質(zhì)的差別，因此對混菌成員之間相互關系的解析也有助于我們進一步理解與應用混菌體系 (表2)。

3.1 代謝缺陷彌補

Li等[73]通過宏基因組分析探究了聚球藻PCC 7002與其他兩種淡水異養(yǎng)微生物——假單胞菌TAIHU和根瘤菌sp. TAIHU在高鹽度條件下所形成的穩(wěn)定混菌體系間的相互關系。該研究發(fā)現(xiàn)，為了應對共培養(yǎng)中的高鹽環(huán)境，PCC 7002會合成并分泌包括蔗糖和甘油葡萄糖在內(nèi)的一些滲透相容性物質(zhì)，這些物質(zhì)除了為體系提供對抗?jié)B透壓、減輕細胞損傷的作用之外，也被認為作為異養(yǎng)細菌可利用的潛在碳源或氮源。而異養(yǎng)菌sp. TAIHU攜帶支持PCC 7002正常生長所需的所有涉及維生素B12的從頭生物合成的基因，以合成維生素B12供藍藻生長使用。同時，兩種異養(yǎng)菌有著強大的脂肪分解能力可為藍藻提供更多的可利用碳源與能量。

除此之外，TAIHU在高鹽度條件下也會分泌一種常見的滲透相容性物質(zhì)——四氫嘧啶，而負責四氫嘧啶及其衍生物的分解代謝的基因僅存在于sp. TAIHU中，這在高鹽度條件消失時去除水體多余的營養(yǎng)物質(zhì)非常重要。同時期，Nelson等[74]也對一些聚生體中存在的無法從頭合成必需的B族維生素相關酶輔助因子微生物的存活機制進行了解析，并發(fā)現(xiàn)混菌體系依賴輔助因子的同種異體代謝作為優(yōu)化的生存策略。這種生存策略可以更好地發(fā)揮各個菌種的優(yōu)勢，使得混菌體系更加穩(wěn)定。

Christie-Oleza等[75]使用天然存在于海洋中的“”相互作用作為光合自養(yǎng)-異養(yǎng)生物模型的研究。研究發(fā)現(xiàn)，雖然在體系中充分發(fā)揮著生產(chǎn)者的作用為異養(yǎng)生物提供賴以生存的有機碳源。但除了陽光和CO2，的生存同樣也依賴異養(yǎng)生物對海洋中一些有機物分解與礦化所產(chǎn)生的含氮、磷等物質(zhì)。這種代謝彌補的生存方式使得更多的營養(yǎng)物質(zhì)在混菌系統(tǒng)乃至海洋生物圈中循環(huán)，該研究顛覆了海洋光自養(yǎng)生物和異養(yǎng)生物競爭相同的稀缺營養(yǎng)物和生態(tài)位空間的普遍看法。與此相反，由于它們在長期穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)中的互補性，它們更可能相互受益。

表2 混菌系統(tǒng)機理解析

3.2 營養(yǎng)限制解除

在碳源匱乏的生存條件下，一些光合微生物混菌體仍可生存。Beliaev等[76]通過轉錄組分析解釋了PCC 7002與腐敗極毛桿菌W3-18-1之間的相互關系。研究發(fā)現(xiàn)，除了通過乳酸氧化或光合固定碳來解除部分碳限制從而發(fā)生生長偶聯(lián)之外，W3-18-1中一些相應的生物物質(zhì)合成的基因，如丙氨酸、甲硫氨酸合成基因的下調(diào)，這表明PCC 7002可為生存環(huán)境提供特定的氨基酸。研究還發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)期間，PCC 7002中與Fe調(diào)節(jié)相關的基因的mRNA水平廣泛降低，表明PCC 7002在共培養(yǎng)期間更容易獲取鐵元素。此外，Bernstein等[77]通過轉錄組分析解析了嗜熱聚球藻BP-1與紅色亞棲桿菌A之間的相互作用關系。BP-1可以為A提供有機碳、氧氣和還原氮，并且由于異養(yǎng)菌的存在，藍細菌生物量的積累和由高濃度溶解的氧氣誘導的抗應激性均增加。該研究闡明了初級生產(chǎn)者藍細菌通過調(diào)節(jié)關鍵代謝基因的表達水平，如光合作用、碳吸收/固定、維生素合成和活性氧物質(zhì) (Reactive oxygen species，ROS) 清除的核心基因的表達來適應異養(yǎng)菌的存在。該研究指出，異養(yǎng)細菌可以間接調(diào)節(jié)光合自養(yǎng)初級生產(chǎn)者的基因表達，導致其一系列的生理變化。

4 合成生物學技術構建人工合成混菌體系

4.1 適應混菌體系構建的光合微生物改造

自然界中由于長期進化而形成的光合微生物混菌體系不勝枚舉，但在應用的過程中缺少靈活性與普適性。如前所述，蔗糖作為一種常見的碳源，其被證實是光合微生物尤其是淡水藍細菌內(nèi)最具代表性的碳水化合物代謝物。大多數(shù)淡水藍藻菌株在遭遇鹽脅迫的環(huán)境下細胞內(nèi)會合成并積累蔗糖作為相容性溶質(zhì)，以抵抗鹽脅迫并維持細胞內(nèi)外的滲透壓平衡，從而保持細胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[78]。對于天然藍藻細胞，當胞內(nèi)積累的蔗糖濃度足以抵抗外界的滲透壓時，蔗糖的合成和降解就處于一種平衡狀態(tài)，這種天然的蔗糖代謝調(diào)控模式從根本上限制了藍細菌蔗糖產(chǎn)量的提升。為了突破這種限制，Ducat等[20]將來自W (一種可天然利用蔗糖的大腸桿菌)的B基因導入PCC 7942，首次實現(xiàn)了藍細菌胞內(nèi)蔗糖的胞外分泌。該方式有效突破了藍細菌蔗糖合成能力的瓶頸，為后續(xù)的人工構建光合微生物混菌體系奠定了基礎。

4.2 人工光合微生物混菌培養(yǎng)體系的建立與應用

利用藍細菌合成有機碳源供給異養(yǎng)菌的生長，是目前構建人工光合微生物混菌培養(yǎng)體系的主流方向。Ducat等[20]通過直接向產(chǎn)糖PCC 7942體系中接種，發(fā)現(xiàn)酵母細胞在此體系中可以很好地維持生存，初步證實了人工構建光合微生物混菌體系的可行性。以此為基礎，Ducat等[22]繼續(xù)探索了3種經(jīng)典的工程菌 (大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌)與產(chǎn)糖PCC 7942的共培養(yǎng)狀況。該研究顯示，大腸桿菌和酵母菌與藍細菌的混菌體系能夠較為穩(wěn)定地維持數(shù)周到數(shù)月的時間，而且在面對環(huán)境波動 (主要為光照的節(jié)律性變化)時，該體系展現(xiàn)了很強的魯棒性并能夠實現(xiàn)一定的高附加值產(chǎn)品的合成，如聚羥基丁酸酯PHB和淀粉酶。隨后，Ducat等[21]利用固定化策略對人工合成混菌體系進行了優(yōu)化，使用海藻酸鈉對產(chǎn)糖PCC 7942進行包埋固定化。這種固定化處理方式已經(jīng)通過實驗證實對藍藻細胞的生存與產(chǎn)糖影響較小，且可以有效地限制細胞數(shù)量的增長，使得通過生長消耗的碳源可以更加有效地轉移到蔗糖生產(chǎn)方面。與非固定化狀態(tài)相比進行了包埋固定化的產(chǎn)糖PCC 7942產(chǎn)糖效率提高了3倍左右。將其與玻利維亞鹽單胞菌(天然的PHB生產(chǎn)者)進行共培養(yǎng)，該人工合成的混菌體系可維持長達 5個月的培養(yǎng)時間，并且在培養(yǎng)過程中始終維持著生物量穩(wěn)定與PHB產(chǎn)量的持續(xù)增長。同樣的，該體系也對環(huán)境波動與外來微生物污染表現(xiàn)出極強的魯棒性與抵抗能力，不需要額外添加抗生素等策略用以維持體系穩(wěn)定。此外，Ducat等還證實，除之外，還可將共培養(yǎng)菌株替換成可用于PHB生產(chǎn)的大腸桿菌，這充分表明了人工合成混菌體系靈活性與普適性。但就現(xiàn)有研究來看，構建人工混菌體系時所用到的異養(yǎng)菌必須具備蔗糖的利用能力，而許多異養(yǎng)菌無法天然利用蔗糖作為碳源。因此需要對異養(yǎng)微生物進行可蔗糖利用化的改造。鑒于此，Lowe等[79]將來自天然可利用蔗糖的W中的AB系統(tǒng)導入惡臭假單胞菌，其中A是蔗糖水解酶，可將蔗糖水解成葡萄糖與果糖，B則可促進蔗糖由胞外轉移到胞內(nèi)，這樣就擁有了蔗糖利用能力，并由此構建了可以進行PHA合成的光驅動混菌系統(tǒng)。

4.3 人工光合微生物混菌體系的拓展與機理研究

為了更好地了解并利用人工合成混菌系統(tǒng)進行研究，Smith等[80]利用棕色固氮菌與產(chǎn)糖PCC 7942構建混菌體系，設計了一種雙向互通式共生系統(tǒng)。該系統(tǒng)里，藍藻為提供蔗糖作為碳源，還可以為藍藻提供氮源，相較于上述體系有了進一步的優(yōu)化，無需額外添加任何有機氮源與碳源即可進行高附加值產(chǎn)物的合成。在現(xiàn)階段的研究中，混菌體系中的異養(yǎng)微生物的生長完全依賴于藍細菌所分泌的蔗糖，但有趣的是，異養(yǎng)微生物也同時促進藍藻的生長，圖1D為人工合成混菌體系的模式圖。Ducat等[22]的研究已經(jīng)證實，混菌培養(yǎng)下每毫升菌液藍藻的細胞數(shù)是單培養(yǎng)下的2–3倍，但有關這種促進作用的具體機理仍處于研究階段。藍藻進行光合作用容易產(chǎn)生活性氧，其在培養(yǎng)基中大量積累會抑制藍藻的生長，Li等[81]在研究產(chǎn)糖PCC 7942和黏紅酵母組成的人工混菌體系時發(fā)現(xiàn)的存在可有效清除體系內(nèi)的活性氧物質(zhì)從而解除藍藻的生長抑制。

5 總結與展望

光合微生物是地球上重要的初級生產(chǎn)者，其高效的光合固碳作用為生物圈提供了近20%的有機碳。有研究還表明，光合細菌營養(yǎng)價值高、凈化水質(zhì)能力強，且具有增強動物抗病力的功能[82]。因此，自然界中以光合微生物存在為基礎的混菌體系不勝枚舉。經(jīng)過數(shù)億年的進化，獨特的生存條件使得各個混菌體系擁有自身獨特的優(yōu)勢與特點。經(jīng)過簡單改良的天然混菌體系在污水處理、高價值物質(zhì)生產(chǎn)等領域已經(jīng)展現(xiàn)了這些天然聚生體的巨大利用價值。但是，這些天然聚生體的應用仍舊存在一定的困難。其一，如何發(fā)現(xiàn)適應生物工程應用的混菌體系。自然環(huán)境中有不計其數(shù)的混菌聚生體，如何更加有效在這些混菌聚生體中找到目的體系是我們迫切需要解決的問題。以污水處理為例，目前使用的混菌系統(tǒng)需要根據(jù)不同的菌株對污水中不同離子的處理能力進行篩選，但篩選菌株的效率依舊非常低，因此，創(chuàng)建更好的菌株篩選方法，高通量篩選目的體系是我們需要探究的方向。其二，如何進一步提高混菌體系的穩(wěn)定性。天然混菌體通常是在自然條件下經(jīng)過長期進化形成互利共生體系，這種混菌體系具有非常高的穩(wěn)定性，但普適性與靈活性較差，這為提高人工混菌體系的穩(wěn)定性提供了一個良好的思路與解決方案。獲得共培養(yǎng)的工程菌株后，利用定向進化的方法將工程菌株進行馴化，避免人工構建的混菌體系其容易崩潰的問題。

想要更進一步解決以上問題，還需要我們對混菌體系之間的相互作用機理進行深入的理解。目前的研究已經(jīng)證實，一些異養(yǎng)菌可以通過改變光合微生物生長環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)或小分子成分來間接地影響光合微生物的基因表達，但是，我們目前對不同種群間相互作用的理論知識的理解尚顯不足。有研究表明，銅綠假單胞菌、大腸桿菌、藍細菌、枯草芽孢桿菌等其種群的細胞數(shù)量會影響到自身的某些基因的表達量[83-86]。在大腸桿菌中，Gupta等[87]已經(jīng)成功將這種群體感應系統(tǒng)應用于工程大腸桿菌的改造，并顯著提高了目標產(chǎn)品的產(chǎn)量，如肌醇產(chǎn)量由0.23 g/L提高至1.28 g/L、葡糖二酸從不可檢測到>0.8 mg/L、莽草酸酯從不可檢測到>100 mg/L。此外，Christie-Oleza等[75]對海洋天然存在的“聚球藻-玫瑰桿菌”共生體系進行解析時還發(fā)現(xiàn)，光合藍細菌與異養(yǎng)菌無論以何種初始接種比例接種于培養(yǎng)基，其種群數(shù)量在體系穩(wěn)定之時雙菌的數(shù)量總會維持在10︰1左右。由此我們可以猜測，除了營養(yǎng)關系之外，是否混菌成員之間也存在著某些群體感應系統(tǒng)，并且這種群感系統(tǒng)對雙菌和多菌的比例調(diào)控起著重要作用。相信這些問題的解決可以使混菌體系應用于更廣泛的領域，同時對理解自然界的進化規(guī)律也有著推動作用。

未來，通過系統(tǒng)運用合成生物學、系統(tǒng)生物學、生物信息學、組學等研究策略，深入解析光合混菌體系種群之間的遺傳和代謝機制，對自然混菌體系進行更進一步的優(yōu)化改進，并構建全新的混菌體系，相信這種技術一定會出現(xiàn)新的發(fā)展與突破。

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Recent progress in photosynthetic microbial co-culture systems

Li Zhang1,2,3, Xinyu Song1,2,3,4, Lei Chen1,2,3, and Weiwen Zhang1,2,3,4

1,,,300072,2,,300072,3,300072,4,,300072,

Co-culture systems consisted of photosynthetic microorganisms and others heterotrophic microbes have attracted great attention in recent years. These systems show many advantages when compared with single culture grown under autotrophic conditions, such as less vulnerable to pollution and more stability, thus have been applied to wastewater treatment, soil remediation, biodegradable harmful substances, and production of high value-added products. In order to explore basic theory and further applications, we summarize here recent progresses in artificial co-culture systems of using photosynthetic microorganisms, to provide a current scientific understanding for the rational design of the co-culture system based on photosynthetic microorganisms using synthetic biology.

photosynthetic microorganisms, co-culture systems, environmental engineering, cell factory, interaction

June29, 2019;

September19, 2019

Supported by: National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFA0903000), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31901016, 31770100, 91751102, 21621004, 31370115, 31470217, 31972931).

Xinyu Song. Tel: +86-22-27404336; E-mail: songxinyu@tju.edu.cn

國家重點研發(fā)計劃(No. 2018YFA0903000)，國家自然科學基金(Nos. 31901016, 31770100, 91751102, 21621004, 31370115, 31470217, 31972931)資助。

10.13345/j.cjb.190288

2019-10-25

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190805.1059.004.html

張麗, 宋馨宇, 陳磊, 等. 光合微生物混菌體系的應用和研究進展. 生物工程學報, 2020, 36(4): 652–665.

Zhang L, Song XY, Chen L, et al. Recent progress in photosynthetic microbial co-culture systems. Chin J Biotech, 2019, 36(4): 652–665.

(本文責編 郝麗芳)