CRISPR/Cas9技術(shù)在觀賞植物改良育種上的應(yīng)用研究進展

謝園園

摘要? ? CRISPR/Cas9技術(shù)是繼ZFN、TALEN后目前新興的基因定點改造技術(shù)手段。本文簡要介紹了CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展演化及優(yōu)勢，總結(jié)了其在觀賞植物上的應(yīng)用現(xiàn)狀及巨大潛力。目前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于百脈根、毛白楊、鐵皮石斛、苜蓿、矮牽牛、日本牽?；?、菊花、蘭豬耳、菊苣等觀賞植物上，為在觀賞園藝上的性狀改良、基因工程研究提供了有力依據(jù)和手段。

關(guān)鍵詞? ? CRISPR/Cas9;觀賞植物;育種改良;基因編輯

中圖分類號? ? S722.5? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）08-0134-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

基因突變是促進物種進化的有效途徑，傳統(tǒng)的自然突變、物理和化學(xué)誘變、T-DNA隨機插入以及轉(zhuǎn)座子等方式無定向性且周期較長[1]?；蚓庉嫾夹g(shù)能利用植物的基因組庫精確改變DNA序列，縮短育種周期，尤其是新興的成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short Palindromic repeats，CRISPR）技術(shù)，在生物、醫(yī)學(xué)及植物領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。如今隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和生活水平的提高，觀賞植物在城市發(fā)展、室內(nèi)外綠化中的應(yīng)用愈加廣泛，花色豐富、花型奇特和抗性強的優(yōu)良觀賞植物產(chǎn)業(yè)需求不斷增加。因此，運用CRISPR/Cas9技術(shù)對觀賞植物進行育種改良具有重要意義。

1? ? 基因編輯技術(shù)的發(fā)展及演化

基因編輯技術(shù)至今一共經(jīng)歷了3代的發(fā)展。第1代是鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFNs），第2代是類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)核酸酶（transcription activator-like effector nu-clease，TALEN）。ZFNs和TALEN原理相似，均攜帶了能產(chǎn)生雙鏈斷裂的催化結(jié)構(gòu)域的限制性核酸內(nèi)切酶FokⅠ，但二者結(jié)構(gòu)復(fù)雜、操作困難且成本高昂，應(yīng)用受限[2-3]。1987年，Ishino等[4]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中存在29個核苷酸重復(fù)序列，這些重復(fù)序列被一些非重復(fù)的短序列間隔開。2000年，Jansen等[5]首次將這種大多數(shù)原核生物中均存在的規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列命名為“CRISPR”。CRISPR及其相關(guān)蛋白（CR-ISPR-associated protein），尤其是Cas9，源自細菌和古細菌[6]，是原核生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，它保護原核生物免受病毒等入侵DNA的侵害，精準、快速、靈活性好，同時體量小，可用于基因敲除、調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達、單鏈RNA編輯、染色體位點活細胞標(biāo)記和高通量基因篩選[7]。該技術(shù)的出現(xiàn)，成為現(xiàn)階段最受歡迎的第3代基因編輯技術(shù)并一直運用在生物學(xué)各領(lǐng)域。

2? ? CRISPR/Cas9技術(shù)原理和相關(guān)優(yōu)勢

2.1? ? 技術(shù)原理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)包含一個非特異性可切割雙鏈DNA的Cas9蛋白和一個控制靶點特異性的向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA），sgRNA將Cas9引至特定的基因組位置，引導(dǎo)Cas9切割目標(biāo)基因雙鏈DNA從而形成雙鏈斷裂（DNA dou-ble strand break，DSBs），其中目標(biāo)基因的3′端是PAM序列（protospacer-adjacent motif，PAM），其下游具有NGG序列才能被Cas9結(jié)合、切割[8]。隨后，DSBs觸發(fā)非同源末端連接（no-nhomologous end joining，NHEJ）或同源重組（homologous rec-ombination，HR）的細胞DNA修復(fù)途徑，產(chǎn)生插入或缺失突變[9-10]。根據(jù)不同的修復(fù)途徑，DSBs實現(xiàn)對不同位點特異性的DNA序列的修復(fù)[11]。其中，NHEJ的修復(fù)主要是在編碼區(qū)引起插入或刪除突變，導(dǎo)致基因敲除;而HR的修復(fù)則需在與 DSBs序列具有同源DNA模板的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)同源DNA序列的定點替換或插入[12]。

2.2? ? CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因編輯領(lǐng)域的優(yōu)勢

普通的轉(zhuǎn)基因植物需整合外源基因進入植物基因組中以產(chǎn)生所需的性狀，而通過CRISPR/Cas9編輯的植物不需引入外源基因即可獲得純合的突變體，且與常規(guī)育種方法獲得的突變體植物一樣具有穩(wěn)定的遺傳能力，減少了普通轉(zhuǎn)基因帶來的倫理爭議[13]。Zhang等[14]在2016年就通過CR-ISPR/Cas9 DNA或RNA的瞬時表達在六倍體普通小麥和四倍體杜蘭小麥中進行愈傷組織再生獲得不含轉(zhuǎn)基因的純合突變體植株，有效刺激了植物更深入的基因工程研究。

植物性狀的表達既可能是單基因，也可能是多基因控制。傳統(tǒng)的育種方法進行性狀改良耗時長且效率不高，而利用CRISPR/Cas9技術(shù)可以更高效地獲得植物基因組中的多個基因突變。不同于常規(guī)育種，CRISPR/Cas9系統(tǒng)中多個sg-RNA可以同時表達[15-16]，且在目標(biāo)序列中產(chǎn)生的特定突變是定向和可控的，這極大地降低了成本和形成多個靶點突變的植物所需的時間。因此，培育性狀理想和優(yōu)良品種植株的效率要遠遠高于常規(guī)突變育種。

3? ? CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在觀賞植物上的應(yīng)用

目前，在基因編輯上進行應(yīng)用的觀賞植物較少，主要有百脈根、毛白楊、鐵皮石斛、苜蓿、矮牽牛、大牽?；?、菊花、蘭豬耳、菊苣等。

3.1? ? 百脈根

百脈根（Lotus japonicus）是一種典型的豆科百脈根屬牧草，具有一定的觀賞價值。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，CR-ISPR/Cas9系統(tǒng)可有效誘導(dǎo)百脈根共生固氮（symbiotic nitro-gen fixation，SNF）相關(guān)基因突變。通過設(shè)計LjU6-1啟動子驅(qū)動的靶向SYMRK基因位點的sgRNA，在20株T0代轉(zhuǎn)基因植物中實現(xiàn)了約35%的誘變效率;此外，設(shè)計了2個靶向3 個同源豆血紅蛋白基因位點（LjLb1，LjLb2，LjLb3）的 sgRNA，獲得20株出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)且每株至少有2個LjLbs基因被破壞的毛根轉(zhuǎn)化結(jié)瘤表型，同時通過sgRNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化實現(xiàn)LjLbs的三倍突變體敲除，驗證了CRISPR/Cas9技術(shù)在觀賞植物上基因敲除的可能性[17]。

3.2? ? 毛白楊

毛白楊（Populus tomentosa Carr.）是一種常見的楊柳科柳屬園林樹木。2015年，F(xiàn)an等[18]以毛白楊PtoPDS基因的不同位點為靶標(biāo)設(shè)計4種sgRNA，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化的植株中觀察到顯著的白化病表型，突變效率約 51.7%，且白化病植株的PDS基因中均含有突變等位基因，且4種sgRNA對Cas9的定向和靶基因的突變產(chǎn)生的貢獻不等，證實了正確選擇sgRNA對有效產(chǎn)生缺失突變至關(guān)重要;此外，對毛白楊基因進行擴增時發(fā)現(xiàn)，Cas9能指導(dǎo)單個轉(zhuǎn)基因植物中2個拷貝基因上的突變，這表明Cas9/sgRNA系統(tǒng)具有一次敲除楊樹基因組中2個或多個基因位點的能力。該研究為CRISPR/Cas9技術(shù)在木本植物上的應(yīng)用提供了首例模板。

3.3? ? 鐵皮石斛

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科石斛屬的一種兼具藥用價值和觀賞價值的植物。Yan等[19]在2015年完成鐵皮石斛的基因組草圖，為鐵皮石斛今后的基因編輯工作奠定了基礎(chǔ)。其后在2017年Ling Kui等[20]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，將包含CaMV35S啟動子、β-葡糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）以及綠色熒光蛋白的pCambia-1301-35SN載體作為報告基因?qū)腓F皮石斛植物組織，成功轉(zhuǎn)錄并翻譯成功能蛋白。同時，選擇5個基因C3H、C4H、4CL、CCR和IRX為靶基因，并對靶基因位點進行PCR擴增，獲得突變率在10%～100%之間的試驗結(jié)果。該項研究是運用CRISPR/Cas9技術(shù)進行植物基因編輯的成功案例，該高效的研究工具不僅有助于育成新的鐵皮石斛品種，而且對蘭花生物學(xué)的分子遺傳學(xué)研究也有重要的參考價值。

3.4? ? 苜蓿

苜蓿（Medicago sativa）是豆科苜蓿屬的一種模式植物，也是世界上最重要的牧草作物之一，同時還可食用及作觀賞綠化用，用途較為廣泛。2016年，Meng等[21]克隆了苜蓿 U6啟動子來驅(qū)動特定sgRNA的表達，并以pFGC5941為骨架，構(gòu)建了雙載體pFGC5941-Cas9，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將含有Cas9和特定pMtU6：：gRNA表達片段的目的結(jié)構(gòu)體引入到蒺藜苜蓿生態(tài)型R108中，在T0代中成功獲得10.35%的MtPDS純合突變體。這項研究為加快豆科觀賞植物性狀改良提供了有力的理論依據(jù)。

3.5? ? 矮牽牛

矮牽牛（Petunia hybrid）是茄科碧冬茄屬一種重要觀賞植物。2016年，Zhang等[22]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對矮牽牛基因組進行靶向誘變，以PDS為靶基因，獲得55.6%～87.5%突變率的白化表型。最近，又有研究人員分析矮牽牛不同花發(fā)育階段PhACO基因PhACO1、PhACO3和PhACO4與花乙烯產(chǎn)量的關(guān)系，檢測發(fā)現(xiàn)3種基因表達量逐步升高，與花朵中乙烯含量的升高趨勢吻合，且ACO1表達量遠遠高于其他2種同源基因。其后利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除PhACO1基因，獲得的T0代突變體株系，與野生型相比均存在乙烯產(chǎn)量顯著降低且花壽命延長的性狀，其中純合突變體中的花壽命延長和乙烯產(chǎn)量的降低要強于單等位基因突變體[23]。

3.6? ? 日本牽?；?/p>

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為有效的基因功能研究工具能定向改良花卉品質(zhì)，延長花的壽命。2017年，日本學(xué)者先后發(fā)表了2篇關(guān)于CRISPR/Cas9技術(shù)成功改良日本牽?；ɑㄉ难芯浚瑸樽匀唤缰衅渌ɑ芑ㄉ牧加N提供了思路。日本牽?；ǎ↖pomoea （Pharbitis） nil）在日本是一種傳統(tǒng)的園林觀賞植物，為旋花科牽牛屬，花色豐富，但由于花瓣中類胡蘿卜素含量極少以致沒有黃色品種。科學(xué)家們通過分析牽?；ǖ幕ò昊ㄉ纬蓹C理，發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenases，CCD）可裂解類胡蘿卜素多烯鏈的特定雙鍵，從而可能影響類胡蘿卜素在花瓣中的積累。因此，研究中利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除白色牽?；?AK77品種中的InCCD4基因，獲得黃色花瓣的AK77突變品種。與正常非轉(zhuǎn)基因植株相比，CCD4突變植株中類胡蘿卜素的含量增加了20倍[24-25]。

3.7? ? 菊花

菊花（Chrysanthemum morifolium）是菊科菊屬植物，世界四大切花之一，具有極高的觀賞價值和經(jīng)濟價值。菊花屬于異源多倍體植物，染色體高度雜合缺乏完整的基因組信息，導(dǎo)致很難將突變引入[26]。2017年，Mitsuko Kishi-Kaboshi等人運用 CRISPR/Cas9技術(shù)編輯菊花的綠色熒光蛋白（CpYGFP）基因，通過靶向CpYGFP基因的不同位點，最終得到CpYG-FP序列突變的菊花突變體[27];之后李 翠等[28]以菊花品種“神馬”為試驗材料，構(gòu)建以菊花赤霉素合成關(guān)鍵酶GA20氧化酶基因DgGA20ox為目標(biāo)基因的載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，成功獲得DgGA20ox基因移碼突變的菊花轉(zhuǎn)基因植株，有效沉默菊花DgGA20ox基因。這些研究為以后菊科植物應(yīng)用基因編輯技術(shù)以及基因工程研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

3.8? ? 蘭豬耳

蘭豬耳（Torenia fournieri L.）是玄參科蝴蝶草屬一種兼具觀賞價值和藥用價值的夏季草花。2018年，研究者們通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)模式植物蘭豬耳中黃酮醇e3-羥化酶（F3H）基因突變，獲得約80%的株系花色發(fā)生變化的T0代，且12個轉(zhuǎn)基因株系中有10個開出淡藍色花的穩(wěn)定表型。而后來通過序列分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系的F3H靶序列發(fā)生了堿基置換、插入或缺失等突變，從而表明這些穩(wěn)定表型是通過內(nèi)源性F3H基因的靶向誘變誘導(dǎo)獲得的[29]。因此，該研究也證實基因編輯可有效實現(xiàn)花色改良，對于花色素以及其他基因功能研究具有重要意義。

3.9? ? 菊苣

菊苣（Cichorium intybus L.）是一種可食用、觀賞的菊科菊苣屬藥用植物[30-31]，很多地方都因其巨大的經(jīng)濟價值對其進行大規(guī)模種植。為獲得產(chǎn)量更高和營養(yǎng)價值更豐富的新品種，科研工作者們對轉(zhuǎn)基因菊苣產(chǎn)生興趣，并由此將CRIS-PR/Cas9技術(shù)成功應(yīng)用于菊苣上。Guillaume Bernard等[32]分別運用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，以AU6啟動子驅(qū)動sgRNA，構(gòu)建誘導(dǎo)菊苣八氫番茄紅素脫氫酶基因（chicory phytoene desaturase，CiPDS）的第5個外顯子定向突變的二元載體，最終在所有突變植株中檢測到雙等位基因突變，且根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法以31.25%的突變率優(yōu)于突變率為4.5%的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。該項研究表明，我們使用CRISPR/Cas9技術(shù)可以成功地進行遺傳改良和生物功能學(xué)研究。

4? ? 目前CRISPR/Cas9技術(shù)在觀賞植物應(yīng)用上的阻礙

4.1? ? 種類繁多，缺乏有效完整的基因組信息

基因編輯是基于DSBs進行修復(fù)的，物種和細胞類型不同時，DSBs修復(fù)途徑的效率也存在一定差異[33-34]，那么對于不同基因類型的觀賞植物的不同遺傳性狀的改良，皆需進行針對性的定向修飾，而這種利用CRISPR/Cas9技術(shù)進行的編輯必須以已知完整的基因組信息為基礎(chǔ)。但與品種相對單一的農(nóng)作物相比，一方面觀賞植物的經(jīng)濟重要性相對較小，導(dǎo)致對其的基因組序列研究和關(guān)注度較少;另一方面觀賞植物商業(yè)品種繁多，其中很多觀賞植物屬于多倍體物種，染色體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因組序列信息不全，未建立有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。因此，為其開發(fā)合適的表達系統(tǒng)和靶序列構(gòu)型有一定的困難，這些都極大地阻礙了此技術(shù)在觀賞植物上的發(fā)展。

4.2? ? CRISPR-Cas9系統(tǒng)自身的脫靶效應(yīng)

sgRNA的識別序列決定CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性，但CRISPR-Cas9系統(tǒng)也可能切割與靶點DNA類似，但有不同堿基的DNA序列，造成與非目標(biāo)DNA序列錯配，從而導(dǎo)致預(yù)期之外的基因突變[35]。2013年，F(xiàn)u等[36]即發(fā)現(xiàn)RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶可以在3種不同類型的人類細胞中引起顯著的脫靶誘變。2018年，Zhang等[37]又通過研究CRISPR/Cas9在擬南芥上的脫靶效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)子代擬南芥突變體中產(chǎn)生更顯著的脫靶效應(yīng)。這種脫靶效應(yīng)會極大地影響基因編輯效率，但穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化是引入突變最有效的途徑。因此，如何提高轉(zhuǎn)化率，將基因編輯片段成功引入目標(biāo)組織仍是一個挑戰(zhàn)。

5? ? 展望

觀賞植物是人類生活不可或缺的一部分，具有重要的觀賞及食用、藥用價值等。CRISPR/Cas9技術(shù)作為功能基因組學(xué)研究和植物生物技術(shù)的重要工具，它的問世和發(fā)展對植物基因工程領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大的影響。目前，該技術(shù)在農(nóng)作物上有較多應(yīng)用，在觀賞植物上應(yīng)用較少，但運用這一技術(shù)可有效改良觀賞植物性狀，提高抗性，延長貨架期，增加美學(xué)價值。與傳統(tǒng)育種相比，CRISPR/Cas9技術(shù)能有效快速改良植物性狀，直接對植物的內(nèi)源基因進行定向修飾，不會引入外源基因，比普通轉(zhuǎn)基因更安全，減少了轉(zhuǎn)基因帶來的倫理問題。但脫靶效應(yīng)等問題也限制和困擾著育種者們。為此，近年來又有一些新的編輯技術(shù)如CRISPR/Cas12a問世，有研究[38]認為，該基因編輯系統(tǒng)在多個物種的編輯過程中相比CRISPR/Cas9脫靶率更低，但因其編輯范圍較窄，所以目前在植物上的應(yīng)用較少，但其為編輯技術(shù)突破阻礙帶來希望。相信通過不斷的技術(shù)進步和條件優(yōu)化，以及觀賞植物完整基因序列的發(fā)掘，在未來不斷完善的基因編輯系統(tǒng)可以在觀賞植物育種改良上發(fā)揮更深遠的作用和現(xiàn)實意義。

6? ? 參考文獻

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