廣東煙區(qū)黃瓜花葉病毒膠體金檢測試紙條的研制及應(yīng)用

鄧海濱 阮小蕾

摘要? ? 為建立一種在生產(chǎn)應(yīng)用中快速簡便的CMV檢測方法，應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫層析原理，研制出一種針對廣東煙區(qū)黃瓜花葉病毒病的快速檢測試紙條。檢測結(jié)果表明，該試紙條檢測病毒的靈敏度為1 g/103 mL。對煙草上危害嚴(yán)重的其他4種病毒均無特異性反應(yīng)。用試紙條對育苗棚煙株進行隨機檢測，結(jié)果與RT-PCR檢測結(jié)果相符率為90%。

關(guān)鍵詞? ? 膠體金試紙條;黃瓜花葉病毒;廣東煙區(qū)

中圖分類號? ? S435.72? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）08-0099-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

Abstract? ? In order to establish a rapid，specific and simple method for detection of cucumber mosaic virus，using colloid gold labeling technique and immunochromatography principle，rapid test strip for CMV in Guangdong tobacco area were developed.The test results showed that the sensitivity of the test strip to virus detection was 1 g/103 mL.None of the other 4 viruses，which were seriously harmful to tobacco，had specific reaction.The test strip was used to test the tobacco seedlings of the seedling shed randomly，and the result was 90% in accordance with the results of RT-PCR.

Key words? ? colloid gold strip;CMV;Guangdong tobacco area

黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）屬于雀麥花葉病毒科（Bormoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cuucmovirus）[1]。其寄主范圍特別廣泛，能侵染100科超過 1 200 種的單子葉和雙子葉植物[2]。CMV是引起番茄花葉病、煙草花葉病等的主要病原。在很多寄主中，CMV還可以與其他病毒協(xié)生，加重病毒的致病性[3]。因其寄主范圍的普遍性與引起病害的重要性，CMV已成為全球最重要的植物病毒之一。

快速、準(zhǔn)確地檢測病毒，對提高煙葉生產(chǎn)效益具有重要意義。防治CMV主要采用抗病毒育種和生產(chǎn)無毒種苗等方法[4-5]。目前病毒的檢測主要通過電子顯微鏡觀察、ELISA和PCR等方法[6]。在實際應(yīng)用中，電鏡檢測和PCR需要有昂貴的儀器;ELISA耗時很長。因此，在煙葉生產(chǎn)實踐上應(yīng)用這些方法進行病毒檢測具有局限性[7]。膠體金免疫層析技術(shù)操作簡單、靈敏，無需特殊設(shè)備便可大規(guī)模檢測[8]，廣泛應(yīng)用于食品安全監(jiān)督、動植物檢疫等領(lǐng)域[9-14]。

為了滿足基層生產(chǎn)單位針對煙草、蔬菜上CMV的快速檢測需求，本研究通過構(gòu)建廣東煙草CMV的單克隆抗體，利用雙抗夾心法，研制出可在10 min內(nèi)同時快速定性檢測CMV的膠體金試紙條。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

1.1.1? ? 試劑及器材。氯金酸、兔抗鼠二抗[15-16]，購自Sigma公司;檸檬酸三鈉（分析純）、BSA，購自廣州精科生物科技有限公司;試驗用水，電阻率 ≥18.2 MΩ，為經(jīng)超純水裝置凈化的二次去離子水。RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒[15，17]，由天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)。Protein A-Agarose親和柱，購自GE Healthcare公司。硝酸纖維素膜、玻璃棉、支持板、玻璃纖維、吸水紙，購自德國S.S公司。

1.1.2? ? 毒源。PVY、TMV、馬鈴薯A病毒（potato virus A，PVA）、煙草蝕紋病毒（tobacco etch virus，TEV）、番茄斑萎病毒（TS-WV），來自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒研究室。CMV，為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒研究室保存的的普通株系[15]，摩擦接種并保存于系統(tǒng)侵染寄主三生煙（Nicotiana tabacum var. Samsun）上。

1.1.3? ? 引物序列。以CMV的CP基因為模板設(shè)計引物，進行RT-PCR擴增，引物序列如下：

擴增片段長度為250 bp。

1.1.4? ? 煙苗。本實驗室育苗棚常規(guī)培育煙苗100株，品種為K326。采自廣東省各煙區(qū)疑似感染病毒樣本150份，品種為K326和云煙87。

1.2? ? 試驗方法

1.2.1? ? CMV抗原的制備。CMV粒子的提純方案采用文端志等[18]的方法進行。

1.2.2? ? CMV單克隆抗體的制備。由提純的病毒顆子作為抗原免疫BALB/c雌性小鼠。72 h后取免疫小鼠的SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞，通過PEG[19]法融合。經(jīng)過培養(yǎng)、篩查，分別獲得表達3種病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。腹水的制備參照尚海麗等研究方法[20]。采用Protein A-Agarose親和柱進行腹水的親和純化，參照產(chǎn)品說明書使用方法，將純化后的單抗于-80 ℃冰箱中保存，待用。

1.2.3? ? 膠體金的制備。采用檸檬酸三鈉還原法[21]制備膠體金溶液，所得膠體金溶液粒徑為25 nm。

1.2.4? ? 膠體金的標(biāo)記。量取20 mL膠體金溶液，將pH值調(diào)至8.5，將0.1 mg病毒單克隆抗體攪拌加入，攪拌 時間30 min，再加入終濃度20%的PEG-20000穩(wěn)定未結(jié)合的膠體金顆粒，在8 700 r/min條件下離心30 min，去除上清，再用金標(biāo)緩沖溶液定容至 1 mL，于4 ℃條件下保存，待用。

1.2.5? ? 金標(biāo)墊的制備。在金標(biāo)墊上均勻涂布標(biāo)記好的膠體金溶液，將此金標(biāo)墊放置于37 ℃條件下烘干120 min，待用。

1.2.6? ? 質(zhì)控線和檢測線的包被。用硝酸纖維素膜分別包被兔抗鼠IgG二抗和病毒單克隆抗體，作為質(zhì)控線和檢測線，放置于37 ℃條件下烘干120 min，待用。

1.2.7? ? 病毒檢測試紙的制備。在背襯板上依次粘貼已制備好的硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊和吸水紙，并用切條機切割成8 mm的條，裝入卡殼，封裝于鋁箔袋中（此鋁箔袋內(nèi)事先裝有干燥劑）。放置于4～28 ℃條件下保存，待用。

1.2.8? ? 樣品檢測和判定標(biāo)準(zhǔn)。取感染病毒的煙草葉片，加入PBS液磨碎。取3～4滴混合液緩慢滴加到加樣孔中，放平試紙卡，160 s內(nèi)觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：若質(zhì)控線處不出現(xiàn)顯色條帶則表示試紙條失效。若試紙條上除質(zhì)控線出現(xiàn)條帶，檢測線處也出現(xiàn)一顯色的條帶，則為陽性結(jié)果。若在試紙條上只有質(zhì)控線出現(xiàn)一條顯色的條帶，檢測線無條帶，則為陰性結(jié)果。

1.2.9? ? 靈敏度試驗。將含有CMV的植物葉片研磨，分別制備成1 g/10 mL、1 g/102 mL、1 g/103 mL、1 g/104 mL、1 g/105 mL、1 g/106 mL的檢測液。取多重病毒檢測試紙條進行檢測，測試其靈敏度。

1.2.10? ? 特異性試驗。用本研究開發(fā)的病毒檢測試紙條分別檢測TMV、PVY、PVA、TSWV，測試其檢測病毒的特異性。

1.2.11? ? 穩(wěn)定性試驗。將制備好的CMV快速檢測試紙密封后在室溫（10～37 ℃）下保存，并在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月后取出，分別檢測陰性和用CMV提純病毒配制的陽性樣品，分析其穩(wěn)定性。

1.2.12? ? 符合率測試。用本研究開發(fā)的病毒檢測試紙條檢測供試煙苗。同時，抽提每株煙苗的總RNA，進行RT-PCR擴增，檢測其是否攜帶病毒。比較2種方法檢測結(jié)果的符合率。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 分泌病毒單抗的雜交瘤細(xì)胞株獲得

取免疫小鼠脾臟細(xì)胞和對數(shù)生長期的SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞，通過聚乙二醇融合獲得雜交瘤細(xì)胞[15-16]，雜交瘤細(xì)胞經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選和培養(yǎng)12 d。用作包被抗原的是感病的煙草組織粗提液，檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體采用間接 ELISA 方法[15，17]，最終獲得13株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

2.2? ? 單抗腹水制備、亞類鑒定

分別取分泌不同病毒的雜交瘤細(xì)胞注入已用降植烷處理的8周齡BALB/c小鼠腹腔內(nèi)[15]，7～10 d后收集單抗腹水。腹水抗純化后的IgG含量為1.87～3.35 mg/mL。采用 Sigma公司的抗體類型和亞類鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體的抗體類型及亞類[16-17]。鑒定結(jié)果表明，13株CMV中有8株 IgG1、3株IgG2a、2株IgG2b[15]。

2.3? ? 靈敏度試驗

本文制備的病毒試紙條檢測CMV最低濃度1 g/103 mL，結(jié)果見圖1。

2.4? ? ?特異性試驗

本研究開發(fā)的病毒試紙條檢測目標(biāo)病毒的特異性好，結(jié)果見圖2，可以看出，試紙條分別檢測CMV、TMV、PVY、PVA、TSWV的測試結(jié)果。

2.5? ? 穩(wěn)定性試驗

制備好的CMV膠體金試紙條分別在第 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月后取出檢測陰性及陽性樣品，檢測線和質(zhì)控線的顯色無明顯變化，表明試紙穩(wěn)定性很好。

2.6? ? 符合率測試

分別在廣東南雄和始興煙草育苗大棚取樣，對比試紙條和RT-PCR 2種檢測方法的陽性檢出率，結(jié)果如表1所示?？梢钥闯?，本研究研制的試紙條對目標(biāo)病毒的檢出與RT-PCR檢出結(jié)果的符合率，南雄取樣點的CMV為90%，始興取樣點的CMV為97.7%，說明試紙條同室內(nèi)RT-PCR檢測方法相比具有較高的符合率。

3? ?結(jié)論與討論

由于雙抗體夾心免疫層析法對抗體的要求較苛刻，需要針對2個不同位點的抗體才能用于配對檢測[22]。從13株單克隆抗體中只篩選配對成功1對抗體，能滿足檢測靈敏度需要。因此，在后續(xù)研究中可繼續(xù)進行免疫，以篩選出多株單克隆抗體，提高其配對幾率。

本研究制備的CMV膠體金檢測試紙條成本低廉，操作簡便、快速，不需要特殊試驗條件，檢測結(jié)果易于肉眼判斷。其對目標(biāo)病毒的檢測特異性良好，敏感度達到1 g/103 mL，填補了國內(nèi)CMV膠體金快速檢測試劑的空白。在進行大量田間樣品檢測試驗后確定本試紙能滿足對田間樣本快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測要求，并且操作簡單方便，適合基層生產(chǎn)單位在煙草漂浮育苗期快速、大量檢測CMV感染煙株，對減少CMV的感染、切斷CMV的傳播途徑、篩選培育無病毒壯苗具有重要作用。

本研究制備的試紙條與RT-PCR檢測的符合率略低，這是由于該樣品含有的病毒量較低的緣故，但其高于90%的符合率完全可以替代進口產(chǎn)品使用。隨著煙草及各種主栽作物綠色防控重大項目的開展，減少化學(xué)農(nóng)藥使用量、降低作物農(nóng)藥殘留成為目前煙草生產(chǎn)目標(biāo)。本研究針對廣東煙區(qū)CMV病毒病研制的快速檢測試紙，可以在煙草苗期通過快檢技術(shù)篩查出可能的毒源，從而減少煙苗帶毒移栽，可以降低植株的田間帶毒率，減少田間抗病毒農(nóng)藥使用，減少經(jīng)濟損失，具有明顯的經(jīng)濟和社會效益。

4? ? 參考文獻

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