器官移植生物樣本庫(kù)的建立及意義

畢博文，馮玉慶，梁昭，王政祿（天津市第一中心醫(yī)院生物樣本庫(kù)，天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300192）

器官移植是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的偉大成就，其在治療各種器官終末期疾病方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［1-4］，我國(guó)器官移植總數(shù)已躍居世界前列。從提倡“循證醫(yī)學(xué)”“轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)”到邁向“整合醫(yī)學(xué)”“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)正悄然發(fā)生著顛覆性的變革。豐富而優(yōu)質(zhì)的人體樣本資源，既是生命個(gè)體生物信息的載體，又是實(shí)施整合和精準(zhǔn)診治的物質(zhì)基礎(chǔ)，更是未來(lái)生命科學(xué)研究的重要保障。移植醫(yī)學(xué)作為跨學(xué)科交叉性前沿學(xué)科，生物樣本彌足珍貴，建設(shè)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化及資源共享的器官移植生物樣本庫(kù)是器官移植領(lǐng)域的基礎(chǔ)性工作，將為臨床診治及科學(xué)研究提供有力支持和重要保障。

天津市第一中心醫(yī)院建立了我國(guó)首家以器官移植為特色的綜合性生物樣本庫(kù)，對(duì)器官移植相關(guān)生物樣本進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化采集、處理和保存，并制定了器官移植樣本采集流程［5］。本研究主要探討在現(xiàn)有流程下保存的生物樣本能否滿足對(duì)分子生物學(xué)研究的需要。

1 材料與方法

1.1 一般資料：隨機(jī)選取2014年9月-2016年9月生物樣本庫(kù)保存的200例惡性腫瘤肝移植患者的組織及血液樣本，包括乙型肝炎肝硬化合并肝細(xì)胞癌132例；丙型肝炎肝硬化合并肝細(xì)胞癌53例；酒精性肝硬化合并肝細(xì)胞癌11例；膽管細(xì)胞癌4例。

1.2 主要設(shè)備：液氮存儲(chǔ)罐、冷藏柜、血液分裝工作站、生物安全柜、切片機(jī)、組織包埋機(jī)、全自動(dòng)組織脫水機(jī)、臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、生物樣本管理系統(tǒng)集、超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、生物顯微鏡。

1.3 主要試劑：DNA、RNA提取試劑盒（日本TAKARA試劑盒）、人淋巴細(xì)胞分離液、無(wú)水乙醇、RNAlater Solution（美國(guó)Ambion試劑）、DEPC水等。

1.4 組織樣本采集和保存：手術(shù)醫(yī)生提前1天通知生物樣本庫(kù)工作人員手術(shù)安排，與患者簽訂知情同意書(shū)并留取術(shù)前血，手術(shù)樣本離體前30分鐘通知樣本庫(kù)工作人員進(jìn)入手術(shù)室。樣本庫(kù)人員提前準(zhǔn)備樣本采集所需物品，負(fù)責(zé)樣本采集人員穿戴防護(hù)服、無(wú)菌手套。樣本離體后護(hù)士完成樣本交接，核對(duì)樣本數(shù)量及信息后即刻將新鮮樣本轉(zhuǎn)移至樣本采集室。參照相關(guān)文獻(xiàn)制定器官移植樣本采集方法［6-8］，對(duì)肝臟進(jìn)行臟面及膈面拍照存檔，隨后對(duì)肝臟進(jìn)行稱重并測(cè)量大小。用無(wú)菌取材刀沿肝臟長(zhǎng)徑做水平切至腫瘤最大面，采集使用無(wú)菌手術(shù)刀在位于腫瘤最遠(yuǎn)端部位采集遠(yuǎn)瘤樣本，然后再在位于腫瘤邊緣3 cm內(nèi)采集腫瘤旁樣本，隨后采集腫瘤組織（腫瘤大小滿足病理診斷需求，腫瘤直徑≥1 cm，腫瘤診斷的組織體積大于腫瘤的50%），采集時(shí)應(yīng)避免出血和壞死區(qū)域，每塊體積為0.5 m3，放入凍存管內(nèi)，即刻放入液氮轉(zhuǎn)運(yùn)罐中保存。若肝臟存在多個(gè)腫瘤組織，應(yīng)依照上述流程分別采集和保存，腫瘤間距≤3cm時(shí)可共用癌旁組織。提取RNA要求樣本采集器械經(jīng)過(guò)DEPC水浸泡4小時(shí)以上方可使用［9］，樣本采集后應(yīng)立即進(jìn)行RNA提取，隨后置于無(wú)菌滅酶的凍存管內(nèi)進(jìn)入液氮保存。如不能及時(shí)提取，也可加入RNAlater置于-20℃保存［10-12］。

1.5 病理對(duì)照的采集和處理：所有保存樣本均應(yīng)與同采集部位取組織一塊，制備石蠟切片用于質(zhì)控檢測(cè)并采集鏡下圖像保存。所有樣本采集應(yīng)避免肉眼所見(jiàn)的壞死、出血、纖維化、鈣化及富含脂肪的部位。制備的石蠟塊與石蠟切片放入常溫蠟塊、切片柜內(nèi)保存。

1.6 體液樣本的采集和保存：留取術(shù)前1天的晨血，術(shù)后血的采集可根據(jù)不同的器官移植并發(fā)癥高發(fā)時(shí)間或臨床科研需求制定采血間隔時(shí)間［13-14］。血樣采集后即刻分離血清、血漿及血沉棕黃層［15-16］，置于液氮儲(chǔ)存。若患者定期進(jìn)行隨訪，可采集隨訪當(dāng)日血液樣本。若進(jìn)行活檢，則采集當(dāng)日血液和尿液樣本。

1.7 主要觀察指標(biāo)：腫瘤樣本采集的準(zhǔn)確性及壞死程度，DNA的樣本生物大分子的完整性，降解程度以及電泳條帶清晰程度等。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤組織壞死程度（圖1，圖2）：驗(yàn)證腫瘤樣本采集部位的準(zhǔn)確性，抽取已入庫(kù)的200例腫瘤對(duì)照石蠟切片進(jìn)行病理分析，結(jié)果顯示200例樣本中有192例腫瘤面積≥80%。

圖1 肝細(xì)胞癌腫瘤組織（HE×4）

圖2 肝細(xì)胞癌腫瘤組織（HE×10）

2.2 樣本的核酸檢測(cè)結(jié)果：將抽取的樣本進(jìn)行RNA提取，經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)分析A260/A280均在1.9～2.0，對(duì)總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)樣本的完整性較好，受檢的200例樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，RNA的28S及18S色帶均較清晰，28S亮度是18S的2倍，幾乎無(wú)拖尾現(xiàn)象，表明RNA的完整性良好（圖3）。同樣提取DNA，利用紫外分光光度計(jì)分析A260/A280均在1.8～1.9，利用凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣本DNA完整性，結(jié)果顯示受檢DNA完整性較好，條帶清晰無(wú)雜帶拖尾等降解現(xiàn)象（圖4），可以滿足科研實(shí)驗(yàn)需求。以上實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)中樣本經(jīng)過(guò)規(guī)范化的采集、處理和儲(chǔ)存可獲得較好的質(zhì)量。血液樣本同樣用此類方法進(jìn)行RNA及DNA的鑒別，結(jié)果合格率分別為90%和92%，基本滿足大多數(shù)科研需求，其中樣本DNA及RNA樣本含量較少的原因考慮為部分移植患者外周血白細(xì)胞含量較低。

圖3 凍存的器官移植樣本RNA電泳圖

圖4 凍存的器官移植樣本DNA電泳圖

3 討 論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的地位日趨重要。倡導(dǎo)實(shí)驗(yàn)研究與臨床應(yīng)用雙向轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)，其實(shí)質(zhì)是理論與實(shí)際相結(jié)合、基礎(chǔ)與臨床相整合。這種基礎(chǔ)研究最終轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，需要長(zhǎng)時(shí)間的驗(yàn)證，生物樣本的研究就是驗(yàn)證的最佳手段，樣本的質(zhì)量決定了科研的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，而生物樣本庫(kù)作為生物樣本資源采集、儲(chǔ)存及分發(fā)應(yīng)用的開(kāi)放性資源共享服務(wù)平臺(tái)，對(duì)于促進(jìn)醫(yī)療學(xué)科建設(shè)和發(fā)展具有重要意義［17-19］。目前，生物樣本庫(kù)依據(jù)樣本與信息分類可分為人群隊(duì)列生物樣本庫(kù)、疾病預(yù)防控制中心（center for disease control and prevention， CDC） 生物樣本庫(kù)、疾病生物樣本庫(kù)和第三方生物樣本儲(chǔ)存中心［20］。器官移植生物樣本庫(kù)屬于疾病生物樣本庫(kù)，疾病生物樣本庫(kù)的特點(diǎn)是其專業(yè)性，根據(jù)臨床疾病特點(diǎn)，采集滿足各類疾病研究相應(yīng)的生物樣本及其信息資源，有利于?？萍膊【珳?zhǔn)醫(yī)療戰(zhàn)略。肝移植治療肝癌合并肝硬化的療效優(yōu)于手術(shù)切除［21-22］，然而移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)制約了肝移植的發(fā)展，攻克移植后肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移難題勢(shì)在必行。據(jù)研究表明，人體樣本可以反映人體真實(shí)的生物標(biāo)志物情況，對(duì)于現(xiàn)有病情診斷及預(yù)后研究都具有重要意義［23-24］，建立規(guī)范化生物樣本庫(kù)可以對(duì)樣本（配對(duì)體液樣本）采集、處理、儲(chǔ)存、臨床資源整合、樣本轉(zhuǎn)運(yùn)及質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)進(jìn)行系統(tǒng)化管理，從源頭上保證樣本的高質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)樣本采集、保存及使用“無(wú)縫對(duì)接”。

組織樣本進(jìn)入樣本庫(kù)前或短時(shí)間內(nèi)，對(duì)樣本病理狀況進(jìn)行評(píng)價(jià)是保證樣本質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，利用病理技術(shù)對(duì)腫瘤占比、壞死程度及細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析對(duì)組織樣本進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，若其中腫瘤成分超過(guò)80%則認(rèn)為質(zhì)量良好，RNA表達(dá)的研究往往要求腫瘤組織成分在70%以上，而DNA水平的研究對(duì)組織成分要求更高，如腫瘤成分不足65%則應(yīng)從實(shí)驗(yàn)中剔除。本研究抽取已入庫(kù)的200例腫瘤中有192例腫瘤面積≥80%，合格率占96%，說(shuō)明樣本質(zhì)量較好可以滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)需求，沒(méi)有達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的8例是由于術(shù)前抗腫瘤治療導(dǎo)致的腫瘤組織壞死所致，因此，生物樣本庫(kù)在采集腫瘤樣本前應(yīng)提前。

隨著分子生物學(xué)研究突飛猛進(jìn)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)研究對(duì)高質(zhì)量腫瘤標(biāo)本的需求日益增長(zhǎng)。降解和被污染的核酸樣本會(huì)導(dǎo)致不一致或者不可靠的結(jié)果，因此，規(guī)范化的采集及保存樣本對(duì)于樣本核酸產(chǎn)物的質(zhì)量至關(guān)重要?，F(xiàn)有的RNA和DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)包括RNA濃度、純度及片段完整性的測(cè)定，本研究利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)200例組織樣本的RNA和DNA純度均在標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間內(nèi)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析條帶清晰且無(wú)雜帶拖尾等現(xiàn)象，說(shuō)明樣本的RNA、DNA純度及完整性良好。此外，特定的生物分析儀（Agilent2100/4200等）通過(guò)整合毛細(xì)管電泳和微流體芯片，可快速對(duì)RNA樣本的完整性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

規(guī)范化的生物樣本庫(kù)除了儀器設(shè)備、試劑耗材、操作流程及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)之外還應(yīng)該建立標(biāo)準(zhǔn)化的倫理審查制度［25］、管理制度和信息化管理才能達(dá)到現(xiàn)代化生物樣本庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)質(zhì)的樣本是進(jìn)行相關(guān)科學(xué)研究的保障［26-27］，規(guī)范化建設(shè)器官移植生物樣本庫(kù)有利于臨床信息資源的整合和樣本質(zhì)量的保障，促進(jìn)器官移植領(lǐng)域科研的發(fā)展，具有重要的臨床和科研價(jià)值。