人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)成骨修復(fù)牙槽突裂的實驗研究

王芳 宋慶高 郭佳男 何葦 陳尚 鄒亞莉

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，貴州 遵義 563000)

先天性牙槽突裂是口腔頜面部最常見的出生缺陷之一，常伴有唇腭裂的發(fā)生。研究[1-2]顯示，每4個唇腭裂患者中就有3個合并有牙槽突裂。牙槽突裂的修復(fù)在現(xiàn)階段臨床應(yīng)用最多的方法是二期自體松質(zhì)骨移植修復(fù)。但具體到臨床個體病例上，往往由于裂隙周圍軟組織量不足或者裂隙過大等原因造成植入骨的暴露導(dǎo)致骨移植修復(fù)失敗，有時甚至根本無法采用植骨的方法，同時還面臨在年幼患者中難以獲得足夠的骨量甚至需要開辟第二術(shù)區(qū)的風(fēng)險。另外，由于移植骨的吸收，還有需要二次手術(shù)甚至多次手術(shù)的風(fēng)險。本課題組前期實驗已經(jīng)將hAMCs分離培養(yǎng)，并在體外成功誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，而且該細(xì)胞在與膠原—明膠海綿復(fù)合培養(yǎng)的過程中生長良好。本研究旨在探討應(yīng)用經(jīng)誘導(dǎo)分化成骨的hAMCs與明膠海綿載體復(fù)合培養(yǎng)后進行移植修復(fù)兔牙槽突裂的實驗效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物 購于遵義醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心健康成年雄性大白兔40只(1.5～2.0 kg/只)。

1.2實驗試劑與儀器 本課題組預(yù)制的未誘導(dǎo)成骨和已誘導(dǎo)成骨并搭載于膠原—明膠海綿進行復(fù)合培養(yǎng)的hAMCs，鼠抗人細(xì)胞核抗體(美國Sigma公司)，鼠抗人波形蛋白抗體(美國Sigma公司)，自動顯微照相裝置(PM20-35，日本Olympus公司)。

1.3牙槽突裂動物模型的建立與修復(fù) 用1%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)經(jīng)實驗動物耳緣靜脈注射麻醉后，口內(nèi)外以碘伏消毒，鋪巾，切開牙齦，暴露左右上中切牙和側(cè)切牙遠(yuǎn)中牙槽突骨面，用牙科電鉆在中切牙及側(cè)切牙遠(yuǎn)中磨除牙槽骨至形成約1.0 cm×0.5 cm的楔形牙槽突裂樣缺損，缺損距側(cè)切牙切緣1.0 cm，縫合創(chuàng)口，形成一個雙側(cè)完全性牙槽突裂動物模型。待牙槽突裂兔傷口愈合后，1%戊巴比妥鈉行耳緣靜脈注射麻醉，常規(guī)消毒鋪巾，沿原切口切開，暴露牙槽突，根據(jù)對牙槽突裂不同的移植處理，將牙槽突裂兔隨機分為四組：A組(植入負(fù)載有hAMCs的膠原—明膠海綿，12只)；B組(植入負(fù)載有經(jīng)誘導(dǎo)成骨的hAMCs的膠原—明膠海綿，12只)；C組(植入未作處理的膠原—明膠海綿，12只)，D組(空白對照，5只)。所有動物在術(shù)后半流質(zhì)飲食1周，之后常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.4實驗標(biāo)本收集與處理 實驗動物于移植后2、4、6、8周分別注射過量戊巴比妥鈉，每次處死2只，第12周處死剩余動物，取下動物顱骨(含上頜骨，顴骨及鼻骨等)，剔除軟組織，在骨標(biāo)本上應(yīng)用游標(biāo)卡尺直接測量上頜前部移植區(qū)牙槽骨厚度。取3次測量的平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析。將左側(cè)移植區(qū)外0.2 cm范圍內(nèi)包括骨，骨膜及肌肉切取下來，4%多聚甲醛固定24 h后，再采用10% EDTA-2Na脫鈣4周，石蠟包埋，切片，進行蘇木精—伊紅染色及抗人細(xì)胞核抗體免疫組織化學(xué)檢測。

2 結(jié) 果

2.1牙槽突裂修復(fù)大體觀察與測量結(jié)果 實驗動物術(shù)后出現(xiàn)術(shù)區(qū)局部輕度紅腫，3～5 d后基本消失，創(chuàng)口均無明顯的感染。大體標(biāo)本觀察：A/B/C組術(shù)后2周，缺損均清晰可見，缺損內(nèi)明顯纖維結(jié)締組織長入，A/B組未見明顯膠原—明膠海綿樣組織；術(shù)后4周，A/B組缺損變淺，缺損底部骨質(zhì)疏松，易剝離，C組缺損邊緣變圓鈍，缺損未見明顯變淺；術(shù)后6周，A/B組缺損明顯變小變淺，缺損內(nèi)有較多疏松骨質(zhì)，而C組缺損稍變淺，缺損內(nèi)側(cè)見少量松軟骨質(zhì)；術(shù)后8周，A/B組骨面粗糙，缺損處見大量骨質(zhì)充填，質(zhì)地較正常骨質(zhì)松軟，骨缺損交界處近骨質(zhì)連續(xù)，C組缺損處也進一步變小和骨折增多，但缺損仍可見；術(shù)后12周，A/B組骨面較光滑，缺損處大量骨質(zhì)充填，中切牙牙根未暴露，C組骨面粗糙，缺損處也見骨質(zhì)充填，但仍存在凹陷，D組缺損內(nèi)側(cè)少許骨質(zhì)沉積，缺損變淺，中切牙牙根暴露或僅有少許骨質(zhì)包繞。第12周各組新成骨平均厚度為：A組(4.51±0.43) mm、B組(4.38±0.66) mm、C組(3.19±0.12) mm、D組(3.08±0.09) mm。A組與B組的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.389，P>0.05)；A組與C組的結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-9.468，P<0.01)；A組與D組的結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-9.795 4，P<0.01)；B組與C組的結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.598，P<0.05)；B組與D組的結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.981，P<0.05)；C組與D組的結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.795，P<0.05)。

2.2牙槽突裂修復(fù)蘇木精—伊紅染色結(jié)果觀察 蘇木精—伊紅染色光鏡觀察結(jié)果示A組在術(shù)后2周成骨細(xì)胞不均勻聚集，有新生毛細(xì)血管，但沒有見明顯的鈣質(zhì)沉積(圖1A)；術(shù)后4周，成骨細(xì)胞聚集區(qū)細(xì)胞和新生毛細(xì)血管均較術(shù)后2周增多(圖1D)；術(shù)后6周，成骨細(xì)胞聚集區(qū)范圍增大，細(xì)胞數(shù)也較前明顯增多，明顯鈣質(zhì)沉積，類骨質(zhì)形成(圖1G)；術(shù)后8周，鈣質(zhì)沉積進一步增多，見新生骨小梁形成(圖1J)；術(shù)后12周，成熟骨質(zhì)增多，但骨小梁排列排列較紊亂，仍可見成骨細(xì)胞聚集區(qū)(圖1M)。B組在術(shù)后2周視野內(nèi)細(xì)胞較多，見紅染的鈣質(zhì)沉積區(qū)及新生血管，還可見炎細(xì)胞浸潤(圖1B)；術(shù)后4周，見成骨細(xì)胞聚集區(qū)，鈣質(zhì)沉積區(qū)鈣質(zhì)沉積明顯，類骨質(zhì)形成，新生毛細(xì)血管和炎細(xì)胞較術(shù)后第2周減少(圖1E)；術(shù)后6周，新生骨質(zhì)較術(shù)后第4周明顯成熟，見新生骨小梁(圖1H)；術(shù)后8周，新生骨質(zhì)較術(shù)后第6周更為成熟，新生骨小梁增多(圖1K)；術(shù)后12周，與術(shù)后8周及A組同時期比較，骨小梁排列整齊(圖1N)。C組在術(shù)后2周骨外側(cè)視野見散在細(xì)胞，未見明顯成骨細(xì)胞聚集區(qū)(圖1C)；術(shù)后4周，骨外側(cè)見細(xì)胞成分稍增多，仍未見明顯成骨細(xì)胞聚集區(qū)，脂肪細(xì)胞較術(shù)后2周增多(圖1F)；術(shù)后8周，骨外側(cè)見細(xì)胞成分較術(shù)后4周增多，見成骨細(xì)胞聚集和鈣質(zhì)沉積(圖1L)；術(shù)后12周，骨外側(cè)見大量脂肪細(xì)胞(圖1O)。

圖1 A/B/C組在第2/4/6/8/12周時的蘇木精-伊紅染色結(jié)果(×200)

2.3牙槽突裂修復(fù)后抗人細(xì)胞核抗體免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 本實驗對12周標(biāo)本進行免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：A組B組均可見細(xì)胞核呈陽性染色的細(xì)胞存活(箭頭所指)，而C、D組均未見抗人細(xì)胞核抗體陽性染色的細(xì)胞(圖2)。

注:A組B組均可見細(xì)胞核呈陽性染色的細(xì)胞存活(箭頭所指)，C、D組均未見抗人細(xì)胞核抗體陽性染色的細(xì)胞。圖2 第12周A/B/C組免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×400)

3 討 論

牙槽突裂的良好重建可以使上頜牙弓的完整性及上頜骨的穩(wěn)定性得以穩(wěn)定有效的恢復(fù)，而且還能矯正鼻底塌陷、關(guān)閉口鼻漏，為之后二期的正畸、正頜打下堅實的基礎(chǔ)[3]。因此，牙槽突裂的重建一直是唇腭裂序列治療的重要組成部分，隨著近年來組織工程技術(shù)的興起，也為牙槽突裂的骨修復(fù)提供了新的策略和途徑[4]。與傳統(tǒng)的自體髂骨松質(zhì)骨移植相比較，組織工程修復(fù)不僅可以明顯減少患者的痛苦和總體費用，還可以避免第二術(shù)區(qū)的開創(chuàng)及其所導(dǎo)致的不良反應(yīng)。在之前的研究中，本課題組已經(jīng)成功將hAMCs分離培養(yǎng)，并在體外誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，同時發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞能夠搭載于膠原—明膠海綿上，且生長良好，可以與膠原—明膠海綿形成復(fù)合體。但hAMCs與膠原—明膠海綿復(fù)合體在體內(nèi)的修復(fù)效果尚需不清楚，故我們決定通過建立兔的牙槽突裂模型，然后將該復(fù)合體移植于兔牙槽突裂處，觀察其修復(fù)效果。

本實驗研究運用牙科渦輪手機切割的手術(shù)方式在兔的上頜骨制造一個1.0 cm×0.5 cm大小的缺損，以此建立一個兔的牙槽突裂動物模型，且缺損大小符合兔頜骨的臨界缺損[5-7]，造模1個月后X-Ray攝片顯示裂隙存在，表明模型構(gòu)建成功，之后采用hAMCs與膠原—明膠海綿復(fù)合體、經(jīng)誘導(dǎo)后的hAMCs與膠原—明膠海綿復(fù)合體、未作處理的膠原—明膠海綿分別修復(fù)實驗動物的牙槽突裂。目前對于牙槽突裂修復(fù)效果評價的方法最常用的是由Bergland等[8]在1986年提出：即根據(jù)植入牙槽突裂間隔內(nèi)的植入骨高度與正常牙槽嵴高度的比例變化，將評價結(jié)果分為四型。Ⅰ型：植入骨高度具有與正常牙槽嵴一致的高度；Ⅱ型：植入骨高度達(dá)到正常牙槽嵴高度的3/4；Ⅲ型：植入骨高度低于正常牙槽嵴高度的3/4；Ⅳ型：植入骨與牙槽突裂缺損區(qū)無骨性粘連，也就是植骨失敗。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，可在較長的一段時間內(nèi)對牙槽突植骨術(shù)術(shù)后的植入骨生長情況進行評價。但是因為本研究的實驗動物是兔，而兔的腭部較為扁平，沒有明顯的牙槽突，所以此方法并不適合，故本實驗采用測量第12周牙槽突缺損區(qū)骨厚度來評價牙槽突裂的修復(fù)效果，即在12周后對移植區(qū)骨厚度進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示A組與B組最終效果上沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。但是蘇木精—伊紅染色后觀察經(jīng)誘導(dǎo)后的hAMCs鈣質(zhì)沉積較早。A組與C/D組的結(jié)果差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；B組與C/D組的結(jié)果差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。大體標(biāo)本觀察，A、B 兩組裂隙間見大量骨質(zhì)充填，裂隙得到修復(fù)，而C組見裂隙內(nèi)側(cè)有骨質(zhì)充填，但是骨面粗糙，缺損處仍凹陷；D組見中切牙牙根暴露，裂隙變淺存，內(nèi)側(cè)見薄層骨質(zhì)；C/D兩組同樣觀察到缺損淺的想象，這可能與缺損內(nèi)側(cè)骨膜為切除，骨膜內(nèi)的成骨細(xì)胞修復(fù)的結(jié)果。此外，我們通過免疫組織化學(xué)染色對第12周的樣本進行檢測，A/B組檢測到抗人細(xì)胞核抗體染色陽性的細(xì)胞，但兩組間的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可兩組與C組相比，結(jié)果差異都有統(tǒng)計學(xué)意義，說明了hAMCs及誘導(dǎo)后的hAMCs能夠負(fù)載于膠原—明膠海綿上并參與了體內(nèi)成骨及骨重建，為將來人類牙槽突裂的修復(fù)重建提供新的策略和途徑，但其具體機制有待進一步研究。

本文圖1，圖2見封三。