人參皂苷Rd對U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響*

楚麗麗，宛蕾

(貴州醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院 藥理教研室,貴州 貴陽 550004)

人參皂苷Rd(ginsenoside Rd,GS-Rd)是從中藥人參中分離的單體成分，屬于稀有皂苷，在三七中約含0.36%～1.47%[1]，可由人參皂苷Rb-1經(jīng)腸道酶代謝獲得，是皂苷經(jīng)腸道吸收利用的形式之一。人參皂苷Rd具有抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡和分化、抑制其生長和轉(zhuǎn)移的作用；還可抗疲勞、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、改善心腦血管、提高機體免疫力[2-7]。此外，還有提高學習能力、抗衰老[8-9]、抗?jié)冃越Y(jié)腸炎[10]、抗肝纖維化[11和抗炎鎮(zhèn)痛[12-14]等作用。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率約占腦腫瘤的46%[15]，5年生存率不超過5%[16]，預后差易復發(fā)[17]。目前此病的發(fā)病機制尚不完全清除，其發(fā)生發(fā)展過程受多因素多步驟影響[18]。傳統(tǒng)治療方法以手術(shù)及術(shù)后放化療為主，但此腫瘤呈侵襲性生長，完全清除難度高，且目前使用的放化療藥物對機體正常組織造成傷害的同時易產(chǎn)生耐藥性[19]。人參皂苷Rd屬脂溶性小分子物質(zhì)，生物活性較強，對正常細胞無毒，在誘導大腸癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等細胞凋亡方面的研究已有報道，但對治療膠質(zhì)細胞瘤方面尚未見報道。因此本研究通過觀察人參皂苷Rd對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞凋亡的影響并探討可能的機制，為其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中的應用提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗藥物：人參皂苷Rd(純度90%以上)，貴州信邦制藥股份有限公司。細胞株：U251細胞系購于中國科學院上海細胞庫。試劑：MTT(四甲基偶氮唑藍)購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司，1,2-丙二醇(批號930309)，購自重慶東方試劑廠，Hoechst33258(碧云天生物技術(shù)研究所)，兔抗CyclinD1單克隆抗體(批號13670111)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。儀器：熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS IX71，日本)，流式細胞儀FACS-Cabiber(美國BD)。

1.2 試驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) U251細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次。

1.2.2Hoechst 33258熒光染色法檢測細胞凋亡 實驗分空白對照組和低(20 μmol/L)、中(40 μmol/L)、高(80 μmol/L)劑量人參皂苷Rd組。將即用型細胞爬片放入6孔板中，U251細胞以2×107/L密度均勻接種于玻片上培養(yǎng)，低、中、高劑量人參皂苷Rd干預48 h，經(jīng) Hoechst33258染色后在熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3流式細胞術(shù)Annexin-V FITC/PI雙染檢測細胞凋亡率 U251細胞給藥處理48 h后收集，冷PBS液洗滌后離心棄上清，加入Binding Buffer繼續(xù)離心棄上清，樣本管加AnnexV-FITC 2.5 μL、PI 2.5 μL，并加入細胞懸液 100 μL，室溫避光孵育15 min?？瞻讓φ展苤患尤爰毎麘乙?00 μL，使用FACSCalibur流式細胞儀(美國 BD公司)收集細胞 30 000個，Cellquest 軟件分析檢測細胞凋亡率。

1.2.4流式細胞術(shù)PI染色檢測細胞周期 接種細胞2×109/L，17 h后細胞貼壁生長后給予不含血清的高糖DMEM溶液培養(yǎng)24 h，給予低、中、高劑量人參皂苷Rd處理48 h。收集細胞密度達到 1×109/L，加入PBS 1.0 mL 混勻，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；冷PBS液洗滌2次，再以2 000 r/min，室溫離心5 min。棄上清后加入含RNase A的PI染液l mL，37 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.5免疫細胞化學法檢測CyclinD1蛋白表達 采用PV二步免疫組化法染色：消化細胞并計數(shù)，將細胞以2×107/L密度接種于預先放置細胞爬片的6孔板中，置 37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，各組給予相應處理后取出細胞爬片自然干燥，4%多聚甲醛室溫固定30 min、0.01 mol/L PBS洗5 min×3次；用0.3% TritionX-100 PBS液通透細胞膜10 min、0.01 mol/L PBS洗5 min×3次；3% H2O2去離子水孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次；分別滴加兔抗人CyclinD1抗體，置于濕盒內(nèi)4 ℃過夜；次日取出濕盒室溫下復溫60 min、0.01 mol/L PBS 洗5 min×3次；滴加二抗，37 ℃孵育30 min、0.01 mol/L PBS 洗5 min×4次；滴加新鮮配置的DAB顯色7 min，自來水充分沖洗終止染色；之后浸入蘇木素染色液復染20 s，自來水沖洗終止復染；梯度酒精脫水(70%、80%、90%、95%、100%)，二甲苯溶液透明5 min×2次，中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察拍片并對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較用單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理，兩兩比較采用t檢驗；P<0.05和P<0.01認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Hoechst33258熒光染色檢測人參皂苷Rd對U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響

Hoechst33258染色結(jié)果顯示，空白對照組有少量U251細胞細胞核呈致密的強熒光團影并出現(xiàn)胞核碎塊，即出現(xiàn)少量凋亡細胞；人參皂苷Rd低、中、高劑量組細胞熒光強度增強且隨著濃度的增加，細胞的上述改變越明顯，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1、圖2。

注：A為空白對照組，B為低劑量組，C為中劑量組，D為高劑量組，箭頭所示為細胞凋亡小體。圖1 Hoechst33258熒光染色檢測人參皂苷Rd對U251細胞凋亡的影響(200×)Fig.1 The effect of ginsenoside Rd on U251 cell apoptosis by Hoechst33258 fluorescence staining(200×)

2.2 流式細胞術(shù)Annexin-V FITC/PI雙染檢測人參皂苷Rd對U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞凋亡率的影響

人參皂苷Rd處理之后U251細胞的損傷中以早期凋亡細胞為主，低、中、高劑量組隨著藥物濃度的增加細胞早期凋亡率也隨之增加，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.1)。見圖2。

注：(1)與空白對照組比較，P<0.01。圖2 Hoechst33258熒光染色、流式細胞術(shù)Annexin-V FITC/PI雙染檢測人參皂苷Rd對U251細胞凋亡率的影響Fig.2 The effect of ginsenoside Rd on apoptotic rates by Hoechst33258 fluorescence staining and Annexin-V FITC/PI staining

2.3 人參皂苷Rd對U251細胞周期的影響

低、中、高劑量組U251細胞G0/G1期比例隨藥物濃度增加逐漸增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與空白對照組比較，低、中劑量組S期所占比例降低，低、中、高劑量組G2/M期所占比例降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：與空白對照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖3 人參皂苷Rd對U251細胞周期的影響Fig.3 The effect of ginsenoside Rd on U251 cell cycle

2.4 人參皂苷Rd對U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞CyclinD1蛋白表達的影響

低、中、高劑量組作用于U251細胞后，倒置顯微鏡下觀察CyclinD1陽性表達部位在細胞核，免疫組化方法染色呈棕黃色。結(jié)果顯示，空白對照組中CyclinD1蛋白表達顏色深，且細胞表達數(shù)目多；而人參皂苷Rd低、中、高劑量組，CyclinD1蛋白表達顏色變淺，與空白對照組相比，低劑量組、中、高劑量組且細胞表達數(shù)目均減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4、圖5。

3 討論

目前研究表明，腫瘤發(fā)生和細胞周期進程有密切聯(lián)系[20-21]，也就是說腫瘤是一類細胞周期性疾病。細胞周期蛋白在細胞周期進程中G1-S、G2-M轉(zhuǎn)換的兩個關(guān)卡進行調(diào)控，其中G1期是決定細胞周期長短的限速期，細胞一旦跨過此點，反復進入細胞周期，直接導致細胞惡性增殖，這是發(fā)生腫瘤的根本原因。CyclinD1參與細胞周期G1到S期的轉(zhuǎn)換[22]，起著重要的正性調(diào)控作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。CyclinD1最早出現(xiàn)于G1期早期，正常情況下呈一過性表達；但是過度表達時可與CDK4/CDK6形成蛋白復合物，激活CDK4和CDK6的活性，蛋白激酶磷酸化失活，使細胞增殖對有絲分裂原的依賴性降低，周期調(diào)節(jié)失控G1期縮短、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡[23]，最終發(fā)生癌變[24-25]。由此可見，CyclinD1表達減少能有效抑制CyclinD-CDK4/CDK6復合物生成，從而不能越過G1期限制點，將細胞阻滯在G0/G1期，不能由靜止狀態(tài)進入細胞周期，影響細胞增殖。本研究顯示，通過常用的血清饑餓法誘導U251細胞停留在G0期，給予Rd作用之后，隨著藥物濃度的增加，G0/G1期所占細胞周期的比例逐漸增加，S期也一定的下降趨勢，同時CyclinD1表達率也逐漸下降。與上述通過CyclinD1表達減少，使其不能越過G1限定點，并將細胞阻滯于G0/G1期，使細胞周期發(fā)生紊亂相吻合。

注：與空白對照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖4 人參皂苷Rd對U251細胞CyclinD1蛋白表達的影響Fig.4 The effect of ginsenoside Rd on the expression of CyclinD1egg white in U251 cells

注：A為空白對照組，B為低劑量組，C為中劑量組，D為高劑量組，箭頭所示為CyclinD1陽性表達。圖5 人參皂苷Rd對U251細胞CyclinD1蛋白表達的影響(PV，×200)Fig.5 The effect of ginsenoside Rd on CyclinD1 expression(PV，×200)

綜上所述，人參皂苷Rd可以有效的抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞的增值，并將細胞阻滯在G0/G1期，其作用可能是通過下調(diào)CyclinD1的表達有關(guān)，但具體的分子機制需要進一步完善。本實驗研究為開發(fā)人參皂苷Rd成為新的治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的候選藥物提供了基本的實驗依據(jù)。