外源生長素對杜梨組培不定芽生根及相關氧化酶的影響

羅嘉亮，李 凡，郝瑞杰，李六林

（山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西 晉中 030801）

杜梨Pyrus betulaefoliaBunge適應性強，因其與梨樹嫁接親和力強，已成為我國北方梨產(chǎn)區(qū)梨樹的主要砧木。目前杜梨繁育以種子繁殖為主，但由于后代變異多，易造成嫁接品種樹勢、抗逆性等方面的差異較大，給梨園的統(tǒng)一管理帶來了難度。組織培養(yǎng)是快速獲得基因型一致的梨砧木繁育關鍵方法之一[1]。而提高組培砧木的移栽成活率，獲得健壯根系是杜梨組培工作中的重要一步，因此，展開組培杜梨根系的相關研究尤其重要。

生長素是植物不定根誘導與發(fā)育過程中的關鍵影響因素[2]。已有研究結(jié)果表明，吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）等對根系發(fā)育都有調(diào)節(jié)作用[3]，但生長素的種類和濃度對不同品種樹種的作用效果存在較大差異。周新華等[4]研究發(fā)現(xiàn)，誘導多花黃精生根的能力，NAA強于IBA和IAA，且在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著NAA濃度的增加，其誘導能力也不斷加強。楊光等[5]在對2種無性系柚木的扦插試驗中發(fā)現(xiàn)，IAA處理的生根誘導效果最佳，其生根率、根生物量、葉面積和株高均高（大）于IBA和NAA處理的。卜祥潘等[6]則認為，IBA更適用于火焰衛(wèi)矛不定芽的生根誘導。

以生長素誘導植物體不定根的發(fā)生，與氧化酶活性的變化密切相關。姜宗慶等人[7]的研究結(jié)果表明，過氧化物酶（POD）活性在生根前期快速上升則有利于插穗基部愈傷組織的形成，而超氧化物歧化酶（SOD）活性在整個生根過程中均處于較高狀態(tài)，這對植株能起到保護作用。扈紅軍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在以IBA誘導桑樹不定根的形成過程中，多酚氧化酶（PPO）活性在誘導期和表達期均升高，而吲哚乙酸氧化酶（IAAO）僅在表達期具有較高的活性因而更利于不定根的形成。目前，有關不同生長素對杜梨生根及根系形成過程中酶活性變化情況的研究還未見系統(tǒng)報道。因此，本研究以杜梨不定芽為試驗材料，通過測定相關生根指標篩選外源生長素的種類，并通過觀察生根過程中莖段基部組織內(nèi)外形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，以明確不定根發(fā)生的類型與部位，進一步了解該生長素誘導不定根形成過程中酶活性的變化規(guī)律，以期為杜梨等難生根植物的生根研究提供理論指導和技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試樹種為杜梨，于2017年5月采自山西省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所梨資源圃，并在山西農(nóng)業(yè)大學梨原種保存與擴繁基地進行了10代的連續(xù)繼代培養(yǎng)。

1.2 試驗設計

選取生長一致、健壯的杜梨不定芽，將其接種于1/2MS+生長素+6 g·L-1的瓊脂+20 g·L-1的蔗糖培養(yǎng)基上，分別選用IAA、IBA、NAA這3種外源生長素，每種生長素設4個濃度（0.1、0.5、1.0、2.0 mg·L-1）處理，以清水為對照（CK），每個處理接種30株，重復3次。在光照培養(yǎng)室內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計生根指標。培養(yǎng)條件：溫度控制在25 ℃左右，光照16 h、黑暗8 h，光強為 2 000～3 000 lx。

1.3 生根指標的測定

杜梨不定芽生根培養(yǎng)30 d后測定各處理的生根率、平均根數(shù)、平均根長和生根指數(shù)、愈傷組織級數(shù)（參考劉永富的分級標準[9]進行分級），其計算公式分別如下：

生根率(%)=生根苗數(shù)/接種時總苗數(shù)×100%；

平均根數(shù)(條·株-1)=生根總數(shù)/接種時總苗數(shù)；

平均根長(cm)=生根總根長(cm)/生根總條數(shù)；

生根指數(shù)=生根率×平均生根數(shù)×平均根長。

在0.5 mg·L-1的IBA處理組開始進行生根培養(yǎng)后，每隔4 d隨機取樣，觀察莖段基部形態(tài)，制作石蠟切片，并將部分莖段基部剪碎后充分混勻，稱取樣品0.5 g，置于液氮中速凍，保存于-80 ℃的冰箱中以備后續(xù)相關酶活性測定之用。

IAAO、PPO、SOD、POD活性的測定，分別參照高俊鳳[10]、盧緒娟等[11]、王學奎[12]、李合生[13]的方法（略作修改）進行。

使用Nikon SMZ18正置體視顯微鏡拍照，記錄不同時期莖段基部外部形態(tài)變化情況，參照侯福林[14]的方法制作石蠟切片，使用Nikon NI-U正置顯微鏡觀察和拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖，使用SAS 9.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源生長素對杜梨不定芽不定根發(fā)生的影響

外源生長素對杜梨不定芽不定根發(fā)生的影響情況見表1，杜梨不定芽生根誘導愈傷組織的觀察結(jié)果如圖1所示。由表1可知，杜梨不定芽不定根經(jīng)不同濃度的NAA、IBA和IAA誘導，其生根率、平均根數(shù)、平均根長、生根指數(shù)和愈傷組織級數(shù)均存在顯著差異。在同一種生長素處理下，濃度分別為0.1和2.0 mg·L-1的處理組的各項生根指標均顯著低于其余2個濃度處理組；對照組不定芽的生根率為0。同在NAA和IBA的處理下，質(zhì)量濃度分別為0.5和1.0 mg·L-1的生根率無顯著性差異，但都顯著高于質(zhì)量濃度分別為0.1和2.0 mg·L-1的處理組。在1.0 mg·L-1的NAA 處理下，其生根率為45.23%，低于0.5 mg·L-1的NAA處理的47.73%，除此之外，其平均根數(shù)、平均根長、生根指數(shù)分別為2.47條·株-1、2.4 cm、2.66，均高于其他處理，但其愈傷組織的級數(shù)為3～4級，其愈傷組織松軟易脫落，故不利于后期移栽成活。在不同濃度的IBA處理下，濃度分別為0.5和 1.0 mg·L-1的處理組的生根率分別高達66.70%和67.20%，其平均生根數(shù)皆為2.37條·株-1，其平均根長分別為1.83和1.80 cm，其生根指數(shù)分別為2.88和2.86，其愈傷組織級數(shù)分別為1和2級。當IAA的濃度分別為0.5、1.0和2.0 mg·L-1時，其生根率、平均根數(shù)、平均根長和生根指數(shù)的差異均不顯著，其愈傷組織級數(shù)分別為1、1～2和3級。

表1 外源生長素對杜梨不定芽不定根發(fā)生的影響?Table 1 Effects of exogenous auxins on adventitious root formation in P.betulifolia adventitious buds

2.2 杜梨不定芽在生根過程中的外部形態(tài)與組織學觀察結(jié)果

在IBA誘導杜梨不定芽生根的過程中其外部形態(tài)與組織學的觀察結(jié)果如圖2所示。從圖2a和e中可以看出，在不定芽生根誘導0 d時，未經(jīng)誘導的不定芽基部顏色為綠色，觀察其組織學切片可知，其內(nèi)部由外到內(nèi)可分為表皮、皮層、韌皮部、維管束形成層和髓，莖段基部未發(fā)現(xiàn)有潛伏根原基，不定根原基屬于誘生根原基類型。經(jīng)外源 0.5 mg·L-1的IBA誘導4 d后，莖基部顏色變紅，局部膨大，圖2b和f顯示，形成層與韌皮部的細胞分裂旺盛，開始誘導球狀根原基細胞。當不定芽生根誘導8 d時，其基部出現(xiàn)愈傷組織，圖2c和g顯示，“個”狀根原基基本形成，并向外生長。當不定芽生根誘導12 d后，圖2d和h顯示，其不定根突破表皮或愈傷組織而露出莖外。

圖1 杜梨不定芽生根誘導愈傷組織的觀察結(jié)果Fig.1 Observation results of induced calli during adventitious bud rooting of P.betulifolia.

圖2 以IBA誘導杜梨不定芽生根過程中其外部形態(tài)與組織學的觀察結(jié)果Fig.2 External morphology and histological observation results of induced rooting process from P.betulifolia adventitious buds by IBA

2.3 外源生長素對杜梨不定芽生根過程中相關酶活性的影響

2.3.1 PPO活性的變化

杜梨不定芽生根過程中相關酶活性的變化情況如圖3所示。由圖3可知，杜梨不定芽的PPO活性隨IBA生根劑誘導時間的推移呈現(xiàn)上升→下降→上升的變化趨勢。處理組不定芽的PPO活性在生根誘導開始即迅速上升，誘導4 d后達到峰值，在誘導4～12 d中持續(xù)下降直至最低值，隨后緩慢上升；對照組不定芽的PPO活性在生根誘導開始便緩慢上升，誘導8 d后達到峰值，在隨后的8～16 d中持續(xù)降低?？偟膩砜矗砑油庠碔BA有利于提高生根誘導4 d時不定芽的PPO活性，誘導后期（8～16 d）PPO的活性，處理組均低于對照組。

2.3.2 IAAO活性的變化

處理組不定芽的IAAO活性隨著不定根誘導時間的推移呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢。在杜梨生根過程中，不定芽的IAAO活性，處理組始終低于同期對照組。處理組不定芽的IAAO活性，在誘導0～8 d時迅速下降，尤其在誘導0～4 d時其下降幅度最大，在隨后的8～12 d中持續(xù)上升，并在12～16 d時保持相對穩(wěn)定的水平。對照組不定芽的IAAO活性呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，在誘導8 d時達到峰值。

2.3.3 POD活性的變化

杜梨不定芽生根過程中，處理組不定芽的POD活性隨誘導天數(shù)的增加而呈現(xiàn)出上升→下 降→上升→下降的變化趨勢，在誘導4和12 d時分別出現(xiàn)第1個和第2個峰值。而對照組不定芽的POD活性只在生根誘導8 d時出現(xiàn)了1個峰值。與對照組的相比，IBA處理組不定芽的POD活性在生根誘導前期（0～8 d）有所提高。

圖3 杜梨不定芽生根過程中相關酶活性的變化情況Fig.3 Changes of related enzyme activities in rooting process of P.betulifolia adventitious buds

2.3.4 SOD活性的變化

處理組不定芽的SOD活性隨著生根誘導天數(shù)的增加總體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在生根誘導后迅速上升，誘導4 d后即達到峰值，隨后緩慢下降。對照組不定芽的SOD活性則呈現(xiàn)出下降→上升→下降的變化趨勢，在誘導0～4 d內(nèi)緩慢下降，隨后迅速上升，在誘導8 d時達到峰值，誘導8～16 d內(nèi)持續(xù)下降。

3 結(jié)論與討論

外源生長素處理可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)源生長素水平來調(diào)節(jié)植物體細胞分裂與生長速度，從而促進不定根原基的形成[15]。在組培快繁中，多采用NAA、IBA和IAA進行不定根的誘導。在火焰衛(wèi)矛不定芽生根培養(yǎng)基中只添加IBA時，其生根數(shù)和平均根長均達到最大值[6]。本研究采用3種生長素誘導杜梨不定芽生根的試驗結(jié)果表明，IBA的生根誘導效果最佳，這與有關研究者對火焰衛(wèi)矛、巴西梨品種Pyrus betulaefolia[16]的研究結(jié)果均類似。楊超臣等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在生根培養(yǎng)基中添加0.1或0.5 mg·L-1的NAA時，植株基部產(chǎn)生大量的愈傷組織。劉永富[9]研究發(fā)現(xiàn)，NAA可使植株莖基部產(chǎn)生較大的愈傷組織，但不利于其移栽成活。以相同濃度的NAA與IBA處理的生根指數(shù)無顯著性差異，但以NAA誘導的生根率較低，愈傷組織較大，阻礙了不定根的生長，這與上述的研究結(jié)果也都一致；但胡勐鴻[18]認為，NAA可抑制愈傷組織的形成，低濃度的NAA可促進歐洲云杉的生根。前人的研究結(jié)果都表明，IAA被基部吸收后性質(zhì)不穩(wěn)定，釋放較多游離的IAA，易被氧化酶氧化，其作用持續(xù)的時間短[19]，這可能是IAA在上述3種生長素處理中誘導效果最差的主要原因。研究中發(fā)現(xiàn)，不同植物對IBA誘導生根所需最適濃度不盡相同[20]，本研究結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1的IBA更利于杜梨不定根的誘導。不同激素配比可能更利于植株生根，后續(xù)研究應使用IBA與NAA或IAA進行不同濃度的配比試驗，以全面提高杜梨不定芽的生根率。

根原基可劃分為潛伏根原基和誘導根原基兩種，誘導根原基的植物多為難生根樹種，需要一定的外源激素誘導才能形成不定根[21]。核桃屬于難生根植物，當其受到激素誘導后，插穗形成層和韌皮部的交叉區(qū)域的細胞分裂旺盛，逐漸形成不定根原基[22]。馬俊紅等[23]研究發(fā)現(xiàn)，蘋果生根類型屬于誘生原基，其不定根形成過程可分為3個時期。本研究切片觀察杜梨莖基部后未發(fā)現(xiàn)潛伏根原基，因此杜梨不定根發(fā)生屬于誘導根原基，據(jù)此可以解釋清水處理下未能誘導出不定根的原因。杜梨不定根起源于韌皮部與形成層的交界處，其發(fā)育過程可分為根原基的誘導、根原基的形成和不定根的伸長，這與劉昊[22]和馬俊紅等[23]的研究結(jié)果均類似。

酚氧化酶（PPO）是一種含銅的酚類氧化酶，將酚類物質(zhì)和IAA的混合液在PPO作用下，酚類物質(zhì)完全消失，IAA含量降低，在高效液相色譜上檢查出3個新物質(zhì)色譜峰[24]。這類新物質(zhì)為“IAA-酚酸”化合物，是一種有助于促進不定根發(fā)生的輔助因子，對植物生根具有重要調(diào)節(jié)作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在生根誘導前期，IBA處理有利于不定芽PPO活性持續(xù)快速上升，合成更多的生根輔助因子，從而促進不定根原基的誘導。本研究與葡萄[26]扦插生根同樣發(fā)現(xiàn)，在生根后期PPO活性呈現(xiàn)下降的趨勢，推測隨著時間的推進，不定芽體內(nèi)酚類物質(zhì)含量降低，PPO活性隨之降低。

吲哚乙酸氧化酶（IAAO）是一種能夠降解IAA的氧化酶，能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)IAA的含量，從而影響不定根的啟動與形成[21]。本研究結(jié)果表明，杜梨不定芽生根過程中IAAO活性在誘導0～8 d時下降至較低水平，有利于提高植物內(nèi)源IAA濃度，從而促進不定根的誘導與形成，而在生根后期（誘導8～16 d），IAAO活性上升有利于降低內(nèi)源IAA含量，從而促進不定根的表達與伸長，這與牡丹[27]和櫻桃矮化砧[28]的試驗結(jié)果一致。但在歐榛[8]和國槐[29]的扦插生根試驗中發(fā)現(xiàn)，在生根誘導前期，IAAO活性升高，降低內(nèi)源IAA濃度，有利于不定根的誘導，而在生根誘導后期，IAAO活性降低，提高內(nèi)源IAA的含量則有利于不定根的生長。這可能是由不同植物體之間生根所需生長素含量差異造成的。

前人研究發(fā)現(xiàn)，在桉樹Eucalyptus[30]和沙生檉柳[31]生根過程中POD活性會出現(xiàn)兩個峰值，本試驗研究中同樣發(fā)現(xiàn)，在生根誘導過程中，POD分別在誘導4和12 d時出現(xiàn)峰值，且其活性均顯著高于對照組，這可能與不定根原基誘導和不定根伸長均有關。但也有研究者發(fā)現(xiàn)，在桑樹[32]扦插生根過程中，POD活性只出現(xiàn)了單峰變化趨勢。杜梨組織中富含多酚等次生代謝物質(zhì)[33]，在酚類物質(zhì)存在的條件下，POD參與生長素的代謝和細胞壁的木質(zhì)化[34]，這可能是IBA處理提高POD活性從而促進生根的原因。

SOD與植物抗逆密切相關，反映了植物抗氧化與自身修復能力。有關研究結(jié)果表明，高活性SOD可以減少自由基對植株的傷害[35]，本試驗結(jié)果顯示，外源IBA處理顯著提升生根誘導前期（誘導4 d）SOD活性，這可能是提高不定根誘導的成活率關鍵因素。SOD活性在整個生根誘導過程中呈現(xiàn)先升后降的趨勢。在生根誘導0～4 d時，不定芽脫離母株，植株處于逆境脅迫中，SOD活性迅速上升，不定芽基部得以保護，有利于細胞分裂，不定根原基的誘導；而在誘導8 d時，愈傷組織出現(xiàn)并對莖基部起到保護作用；誘導12 d后，不定根開始向表皮外伸長，不定芽長成完整植株，其抗逆能力增強。因此，誘導8～16 d時，SOD活性處于下降水平，這與柃木[36]和薄殼山核桃[7]的研究結(jié)果一致。上述4種氧化酶主要通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素水平，從而影響不定根的發(fā)生，后續(xù)研究應測定內(nèi)源激素含量，分析酶如何調(diào)節(jié)激素來影響生根，并結(jié)合不定根發(fā)育過程的轉(zhuǎn)錄組學，深入揭示杜梨不定根發(fā)生的分子機理。

綜上所述，外源IBA對杜梨不定芽不定根發(fā)生效果最好，當其濃度為0.5 mg·L-1時，各項生根指標均較理想，且愈傷組織較小，有利于后期的移栽成活。不定根發(fā)生屬于誘生根原基，起源于韌皮部和維管束形成層的交界處，其發(fā)生過程包含三個時期。IBA處理改變了不定根誘導過程中PPO、IAAO、POD、SOD的活性，其共同作用影響著不定根的誘導與生長。