不同引種黑莓品種的遺傳多樣性分析

張春紅，王小敏，閭連飛，李維林，吳文龍

（1.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇 南京 210014；2.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037）

黑莓Rubusspp.隸屬于薔薇科Rosaceae懸鉤子屬Rubus，為第3代小漿果類果樹的一種特色類型，其果實含有人體必需的可食纖維質(zhì)、基礎(chǔ)維生素、礦質(zhì)元素及酚類物質(zhì)等，受消費者青睞[1]。懸鉤子果樹遺傳背景較為復(fù)雜，且不同倍性種質(zhì)的親和性較低，使得其常規(guī)育種工作進展較慢。SSR（simple sequence repeats）又稱“簡單序列重復(fù)”，是20世紀80年代發(fā)展起來的一種新型DNA標記，具有多態(tài)性豐富和共顯性等顯著優(yōu)點，被廣泛用于不同樹種的品種鑒定、種質(zhì)資源研究、遺傳圖譜構(gòu)建以及標記輔助選擇等[2-3]。利用已報道的SSR標記開展雜交品種系譜分析[4]、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和基因定位[5]以及黑莓雜交品系鑒定[6]，證實SSR引物在黑莓種質(zhì)資源鑒定和育種中具有極好的應(yīng)用潛力。然而，黑莓品種多由懸鉤子種質(zhì)高度雜合選育而來，種質(zhì)遺傳背景不清晰，使得種質(zhì)鑒定、雜交育種、種質(zhì)挖掘等具有一定難度，現(xiàn)有可用于分析的SSR引物也具一定的局限性。因而，有必要利用現(xiàn)有的生物學(xué)手段開發(fā)更多適用性好的SSR引物用于黑莓種質(zhì)鑒定，這有利于了解現(xiàn)有種質(zhì)品種遺傳基礎(chǔ)，為開展雜交組合親本選配及輔助選擇育種提供現(xiàn)實依據(jù)。

品種遺傳多樣性一方面表現(xiàn)在表型性狀上的差異，可根據(jù)表型及生長性狀進行種質(zhì)遺傳多樣性評價[7]；另一方面，分子標記的發(fā)展為從DNA水平上檢測品種及品系間的遺傳多樣性提供了有利工具。近年來，基于高通量測序技術(shù)開發(fā)分子標記逐漸成為一種獲取特異標記位點的有效方法[8]?；谵D(zhuǎn)錄組測序發(fā)掘的EST-SSR標記作為共顯性標記具有特異性和多態(tài)性好等諸多優(yōu)點，可有效用于物種鑒定和遺傳多樣性分析[9]。EST-SSR標記作為編碼序列的一部分，基于基因編碼區(qū)開發(fā)，能夠作為某些性狀或者基因的直接功能基因標記。本研究中基于課題組前期黑莓轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，搜索分析其中EST-SSR標記，對具有應(yīng)用潛力的標記進行驗證和開發(fā)，旨在利用多態(tài)性好的標記進行現(xiàn)有黑莓品種間遺傳多樣性分析，為檢驗EST-SSR標記的可行性及黑莓雜交組合配制親本選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為課題組從國外引進的18份黑莓品種，種植于江蘇南京溧水白馬科學(xué)基地，其名稱、育種原地和系譜等信息見表1。于旺盛生長期采集各黑莓品種幼嫩葉片，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取

參照文獻[10]，采用CTAB法提取黑莓基因組DNA。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳法檢測其質(zhì)量，將DNA質(zhì)量濃度稀釋至50 ng/μL后，置于-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR序列的篩查與鑒定

EST-SSR序列來源于前期黑莓品種‘Boysenberry’轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果[11]。利用MISA工具篩查SSR序列，根據(jù)測序結(jié)果分析ESTSSR序列（≥20 bp），進一步選取其中部分序列用于黑莓品種遺傳多樣性分析。篩查標準為SSR位點側(cè)翼序列長度不小于50 bp，2、3、4、5和6核苷酸的最小重復(fù)次數(shù)分別為10、7、5、5、5次，EST序列長度大于100 bp。共初步篩查到127個符合要求的SSR序列，分別將其編號為Rh1～Rh127。

1.2.3 SSR引物的設(shè)計與合成

根據(jù)上述檢測到的序列和位點，使用Primer 3設(shè)計SSR引物。引物設(shè)計標準：引物序列中無SSR；序列在DNA保守序列區(qū)內(nèi)；長度18～24 bp；上下游引物不存在互補序列；引物自身不存在互補序列；引物退火溫度50～65 ℃；上下游引物的退火溫度差值不大于5 ℃；GC含量40%～60%；產(chǎn)物大小為100～400 bp。篩選到的2～6核苷酸重復(fù)基序的127對EST-SSR引物（Rh1～Rh127），由上海捷瑞生物工程有限公司合成，用于后續(xù)引物篩選和品種鑒定。

1.2.4 SSR引物的擴增篩選

利用上述EST-SSR引物，擴增黑莓的基因組DNA。PCR擴增反應(yīng)體系的總體積為20 μL，其中包括1 μL 50 ng模板DNA、10 μL 2×Taq PCR Master Mix（含有Taq酶、dNTP和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液）、10 μmol/L的上游和下游引物各1 μL，7 μL的ddH2O。PCR反 應(yīng) 程 序：94 ℃預(yù)變性 5 min，然后進行30個擴增循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃變性30 s，復(fù)性（45～60 ℃）30 s，72 ℃延伸 30 s，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增反應(yīng)在ABI Veriti96 PCR儀上進行。

表1 18個黑莓品種的名稱、系譜和原產(chǎn)地Table 1 Names, parentages and breeding locations of 18 Rubus spp.cultivars

反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物加入2 μL 6×loading buffer，以50 bp DNA Ladder為DNA相對分子質(zhì)量標準，采用8%的非變性聚丙烯酰胺進行電泳，電泳緩沖液為1×TBE，150 V穩(wěn)壓電泳120 min，以藍色條帶跑至距聚丙烯凝膠底部1/3左右為宜。電泳結(jié)束后，用0.2%AgNO3染色和拍照。利用篩選出的多態(tài)性好的SSR引物對各種質(zhì)資源的黑莓基因組總DNA樣品進行PCR擴增，根據(jù)條帶擴增情況統(tǒng)計穩(wěn)定擴增出清晰目的條帶的引物。

1.2.5 SSR引物在黑莓品種遺傳多樣性分析中的應(yīng)用

用上述篩選得到的127對引物進行SSR擴增，隨機選擇品種模板用于引物及最適退火溫度的篩選，各引物對應(yīng)的最適退火溫度通過梯度PCR試驗確定。記錄每個樣品每對引物的DNA擴增帶型，將多態(tài)性穩(wěn)定的引物的擴增結(jié)果拍照。將其條帶大小與相對分子質(zhì)量標準進行比對記載，將有條帶標記為“1”，無法正確辨別帶型以“0”表示。根據(jù)DNA擴增帶型區(qū)分鑒定黑莓品種，帶型數(shù)據(jù)用于后續(xù)遺傳多樣性分析。通過分析EST-SSR結(jié)果，比較品種間多態(tài)性位點的差異，確定引物的多態(tài)率和多態(tài)信息量。使用NTSYS-pc Ver.2.10e軟件進行基于UPGMA法的聚類分析，使用Picalc 0.6軟件計算各引物的位點多態(tài)性信息含量（PIC）值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性擴增產(chǎn)物的篩選

將127對SSR引物進行擴增，篩選引物適合溫度并檢測目的條帶情況，發(fā)現(xiàn)除Rh15和Rh127外其余125對引物均可擴增出條帶。將125對引物用于18個品種的擴增鑒別，發(fā)現(xiàn)有特異條帶且大小符合預(yù)期的引物共50對。50對引物中有多態(tài)引物為45對（表2），占引物數(shù)的36%，進一步將45對引物用于黑莓品種種質(zhì)的遺傳多樣性分析。

2.2 多態(tài)性引物擴增產(chǎn)物的多態(tài)性

45對多態(tài)性引物中，多數(shù)引物擴增的位點數(shù)為2～5。用45對多態(tài)性引物在18份材料中共檢測到191個等位基因變異，平均每個SSR位點有4.24個，變幅為2～8個。位點PIC為0.427～0.893，平均0.692。基本可有效檢測出不同品種間材料的SSR差異位點，具有較高的遺傳多樣性代表性。

根據(jù)45對條帶清晰、多態(tài)性好、穩(wěn)定性好、便于統(tǒng)計的引物擴增結(jié)果，利用UPGMA對18份不同類型的材料進行聚類分析（圖1）。從聚類群中可以看出，18份材料可被明顯分為3個大類群，從上至下分別包括7、8和3個品種，分別記為第1、第2和第3類群。第1類群中，除Brazos產(chǎn)地為德克薩斯州外，其余均由阿肯色州立大學(xué)選育。第2類群中8個品種均由美國農(nóng)業(yè)部推選，第3類群中3個品種產(chǎn)地來源不同，Boysenberry和Youngberry均為七倍體，Black Butte為六倍體。

表2 黑莓多態(tài)性EST-SSR引物序列及多態(tài)性檢測結(jié)果Table 2 Polymorphic EST-SSR primer sequences from Rubus spp.and ploymorphism detection result

45對引物中，多態(tài)性較好的引物有Rh121，檢測到8個等位基因，其次是Rh114和Rh118，均可檢測到7個等位基因，有7對SSR引物（Rh37、Rh40、Rh74、Rh100、Rh103、Rh111、Rh115）可檢測到6個等位基因，另有7對引物檢測到5個等位基因。Rh72、Rh100、Rh118、Rh121分別可檢測到5、6、7、8個等位基因，擴增結(jié)果如圖2所示，這些引物擴增產(chǎn)物條帶清晰，或易于區(qū)分18份材料，因此具有較好的應(yīng)用價值。

圖1 基于遺傳相似系數(shù)的18個黑莓品種的聚類分析Fig.1 Cluster analysis result of 18 Rubus spp.cultivars based on genetic similarity coefficients

圖2 4對多態(tài)性好的SSR引物對18個黑莓品種基因組DNA的擴增圖譜Fig.2 Amplification maps of genomic DNA from 18 Rubus spp.cultivars by using four polymorphic EST-SSR primers

3 結(jié)論與討論

自1986年由江蘇省中國科學(xué)院植物研究所引入國內(nèi)以來，黑莓在生產(chǎn)上表現(xiàn)出良好的潛力，但其遺傳背景復(fù)雜且種間親和性低等因素使得育種進展緩慢。將SSR標記用于不同物種品種鑒定及遺傳多樣性分析上的研究已有大量報道，但應(yīng)用于懸鉤子屬果樹黑莓開發(fā)利用的研究鮮見報道，目前僅有Lewers等[12]進行EST文庫搜索和Castillo等[13]建立基因組文庫開發(fā)SSR標記的報道。本課題組前期通過對1年生黑莓枝莖尖進行轉(zhuǎn)錄組測序，預(yù)測搜索到3 393個EST-SSR標記，發(fā)現(xiàn)重復(fù)位點長度在20 bp以上的1～6堿基重復(fù)的SSR數(shù)目為338條[11]。在此基礎(chǔ)上，本研究中設(shè)計了其中不同重復(fù)基元多態(tài)性潛能高的127對SSR引物，擴增黑莓基因組DNA后，發(fā)現(xiàn)僅2對無擴增產(chǎn)物，表明所設(shè)計引物具有良好的擴增效果。125對引物中有45對呈現(xiàn)多態(tài)性，利用這些引物對18份黑莓品種樣品進行遺傳多樣性檢測，結(jié)果表明這些引物多態(tài)性信息含量豐富，可進一步用于懸鉤子果樹黑莓品種雜交鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等育種研究。

本研究中所用的引進黑莓品種主要來源于美國俄勒岡州和阿肯色州的兩大黑莓育種中心，且多為四倍體[14]。從系譜分析和育成地點來看，供試材料中有6個引進品種均由美國阿肯色州立大學(xué)黑莓育種試驗站選育（表1），在聚類分析中明顯聚在一起，可能與其親本來源種質(zhì)成分具一定相似之處有關(guān)。如Natchez品種雖選自Clarksville，但因系譜中含Arapaho品種成分而與Arapaho距離較近。Brazos由馬里蘭大學(xué)選育，但Natchez[15]、Arapaho[16]、Choctaw、Shawnee、Comanche系譜中均有Brazos成分，因而Brazos距離這些品種較近。另一四倍體黑莓類群中，已知產(chǎn)地的品種均來自美國農(nóng)業(yè)部俄勒岡州，盡管有些系譜來源不詳，根據(jù)其較近的親緣關(guān)系聚類結(jié)果推測，相似產(chǎn)地的品種可能具有某些相似遺傳種質(zhì)成分。此外，Hull和Chester均由美國馬里蘭州Beltsville試驗中心選育，其系譜近似（表1），但根據(jù)擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)其帶型有一定差距，表明其遺傳背景有一定差異，這與2個品種植株的田間表現(xiàn)差異較大也基本一致，一定程度上反映了黑莓雜交重組中的復(fù)雜性[6]。3個多倍體黑莓品種六倍體Black Butte[17]、七倍體的Boysenberry和Youngberry[18]距離較近，可能一定程度上與其復(fù)雜但相似的遺傳種質(zhì)成分有關(guān)。

隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的標記類型被開發(fā)和應(yīng)用，目前已有基于SSR和EST-SSR標記的四倍體黑莓連鎖圖譜的報道[5]，SSR標記在遺傳背景復(fù)雜的黑莓遺傳分析中的應(yīng)用展現(xiàn)出廣泛的前景。本研究中基于轉(zhuǎn)錄組測序篩選出多態(tài)性較好的45對EST-SSR引物，其可應(yīng)用于分析現(xiàn)有黑莓品種種質(zhì)的遺傳多樣性，且發(fā)現(xiàn)目前引種黑莓種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)相對較窄。本研究中僅對目前江蘇地區(qū)栽植的主要黑莓引種品種進行了評價，所用的EST-SSR引物也僅來自于1年生營養(yǎng)莖尖測序結(jié)果，因此須開發(fā)和挖掘更多的EST-SSR和SSR標記進行綜合深入評價。在下一步的黑莓育種工作中，將從引進更多來源地黑莓種質(zhì)資源、挖掘國內(nèi)懸鉤子屬野生種質(zhì)資源以及利用多種育種方法創(chuàng)制黑莓種質(zhì)資源等方面開展研究。