BDM支架“人工羊膜”的制備及立體培養(yǎng)的初步實(shí)驗(yàn)研究

李會(huì)興，趙 菁，尤孟媛，任峻青，韓 磊，肖雁冰

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院 婦科，貴州 遵義 563000)

宮腔粘連(Intrauterine adhesions,IUA)是婦科常見病[1]，嚴(yán)重影響女性生殖健康和生育能力，是造成繼發(fā)不孕的主要因素之一[2-4]。以宮腔粘連分離術(shù)(Transcervical resection of adhesion,TCRA)為主的綜合治療是IUA最主要的治療手段[5]，其中，TCRA術(shù)后人新鮮羊膜(Fresh human amniotic membrane, hFAM)宮腔移植具有較大優(yōu)勢(shì)[6-8]，但是，由于hFAM干細(xì)胞含量少，同時(shí)存在法律、安全和取材等問題，限制了其臨床應(yīng)用。

研究表明[9-11]，內(nèi)源或外源性干細(xì)胞是子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)的基礎(chǔ)，因此，從“從仿生學(xué)”角度，模似hFAM制備富含干細(xì)胞的“人工羊膜(Artificial amniotic membrane,AAM)”，對(duì)其生物活性、力學(xué)性能、轉(zhuǎn)化效果、材料降解和免疫原性等問題進(jìn)行系列研究，并不斷加以改進(jìn)，就有可能最終制備出可以彌補(bǔ)hFAM不足的人工羊膜制品，為治療IUA提供新的思路與方法。

本研究是制備AAM的初步研究，采用羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)、BD-基質(zhì)膠(BD-matrigel,BDM)、 DMEM/F12結(jié)合，體外制備AAM，并將其置于三維立體培養(yǎng)體系中進(jìn)行培養(yǎng)，研究hAMSCs能否在AAM存活并具有增殖活性，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、10%胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購于美國GIBCO公司，BDM購自BD公司，長期冷凍保存于-20 ℃呈固體狀，0℃為液體狀，室溫下迅速成膠。AnnexinV-FIFC細(xì)胞凋亡試劑盒、ELISA試劑盒購自RD公司。胎盤收集于遵義市婦幼保健院產(chǎn)科正常足月分娩的6名健康產(chǎn)婦，無妊娠并發(fā)癥，并獲得產(chǎn)婦及家屬的同意。本研究獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞分離提取及培養(yǎng) 將羊膜剪至1 mm大小碎片后，加入0.25%胰蛋白酶消化2次，每次30 min。加入Ⅱ型膠原酶消化1 h，室溫下(20 ℃)收集細(xì)胞濾液，離心機(jī)1 000 rpm離心5 min，棄上清，收集hAMSCs，重懸于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(含100 U/mL 青鏈霉素)中，37 ℃恒溫孵育。培養(yǎng)液每2天更換1次，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，1∶3傳代。本實(shí)驗(yàn)均采用3代的細(xì)胞。

1.2.2 人工羊膜的制備及分組 無血清DMEM/F12培養(yǎng)基按1∶3稀釋BD基質(zhì)膠后分裝入凍存管。實(shí)驗(yàn)前冰浴融化預(yù)先分裝的BD基質(zhì)膠，于冰上將培養(yǎng)的hAMSCs與基質(zhì)膠(濃度為50 μL/ cm2生長面積的基質(zhì)膠)按1∶1混合注入24孔板中，制成底面積為2 cm2、厚度約3～5 mm、細(xì)胞濃度為3×105/ mL的圓形薄膜，即“人工羊膜”。37 ℃培養(yǎng)箱放置30 min使其成膠后，加入適量 DMEM/F12 完全培養(yǎng)基，隔天換液。其中二維培養(yǎng)組為對(duì)照組，人工羊膜組即三維組為實(shí)驗(yàn)組。同一孕婦胎盤來源的hAMSCs分別接種于觀察組和對(duì)照組的一個(gè)孔內(nèi)，共6組。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 自細(xì)胞培養(yǎng)起，分別在第1、4、7天應(yīng)用倒置相差顯微鏡對(duì)細(xì)胞的生長、形態(tài)等情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)追蹤觀察，對(duì)比兩組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測(cè) 通過消化、吹打、離心、重懸等步驟分別收集對(duì)照組(不含BD基質(zhì)膠)和實(shí)驗(yàn)組約1×105個(gè)的間充質(zhì)干細(xì)胞，用AnnexinV-FIFC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)行染色，計(jì)算AnnexinV-FIFC/PI陽性細(xì)胞比例，并檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 ELISA測(cè)定血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá) 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞以同等密度種植在6孔板中，加入DMEM/F12培養(yǎng)48h，收集其培養(yǎng)基，室溫下(20℃)離心機(jī)1 500 rpm離心5 min并儲(chǔ)存在4℃。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒測(cè)定血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)濃度。

2 結(jié)果

2.1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的表型鑒定 第3代培養(yǎng)的hAMSCs細(xì)胞表面CD44、CD73、CD90以及CD105呈高表達(dá)，而CD45/34/11b/19/HLA-DR呈低表達(dá)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志(見圖1)。

圖1 hAMSCs細(xì)胞表面抗原的表達(dá)情況

2.2 “人工羊膜”的整體外觀 第3代hAMSCs與BDM按體積1∶1混合，制作成底面積為2 cm2、厚度為3～5 mm、細(xì)胞濃度為3×105/mL的圓形均勻薄膜，即“人工羊膜”(見圖2)。

圖2 “人工羊膜”的整體外觀

2.3 不同組別間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 第3代培養(yǎng)的hAMSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組hAMSCs 3～4 h開始貼壁，48 h左右細(xì)胞呈完全貼壁生長，7 d時(shí)細(xì)胞融合達(dá)90%，光學(xué)顯微鏡下可觀察到呈均一長梭形的間充質(zhì)干細(xì)胞(見圖3A)。實(shí)驗(yàn)組hAMSCs則表現(xiàn)為均勻分布，呈不規(guī)則球形生長(見圖3B)。兩組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，漂浮細(xì)胞數(shù)量少。

A：對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)第7天；B：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)第7天。圖3 hAMSCs細(xì)胞形態(tài)

2.4 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組hAMSCs凋亡率及VEGF平均表達(dá)量的比較 細(xì)胞凋亡率的比較，經(jīng)過Annexin-V FITC染色后，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組hAMSCs凋亡率分別為4.91%、2.90%(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4、表1)。采用ELISA法對(duì)VEGF的表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞VEGF的表達(dá)量分別為(616.58±18.01) pg/mL和(579.91±38.94) pg/mL，經(jīng)檢驗(yàn)，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.063,見表1)。

A：對(duì)照組；B：實(shí)驗(yàn)組。圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hAMSCs細(xì)胞凋亡

組別細(xì)胞凋亡率(%)VEGF(pg/mL)對(duì)照實(shí)驗(yàn)4.91±1.352.90±0.96Δ616.58±18.01579.91±38.94

與對(duì)照組比較， Δ：P<0.05。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，將含有DMEM/F12培養(yǎng)基的hAMSCs懸液與BDM按體積1∶1混合制成的“人工羊膜”外觀透明，常溫下呈近似果膠凍狀(見圖2)；鏡下見：hAMSCs均勻分布，呈不規(guī)則球形生長，且生長狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)更加接近于間充質(zhì)干細(xì)胞原有特點(diǎn)，這種特征可能更有利于hAMSCs經(jīng)體外大規(guī)模培養(yǎng)后維持細(xì)胞的干性(見圖3B)，為后續(xù)AAM向子宮內(nèi)膜定向轉(zhuǎn)化的研究提供更具有“干性”的hAMSCs；對(duì)照組hAMSCs呈均一長梭形生長(見圖3A)。鑒于VEGF在創(chuàng)傷修復(fù)和血管再生過程中發(fā)揮重要作用[12-13]，本研究通過檢測(cè)VEGF在蛋白水平的表達(dá)量，來對(duì)比二維和三維狀態(tài)下hAMSCs的分泌能力，發(fā)現(xiàn)三維條件下生長的hAMSCs與二維條件下VEGF的表達(dá)量無顯著差異，提示以BDM支架并不影響hAMSCs原有的分泌功能(見表1)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組hAMSCs的凋亡率結(jié)果顯示三維生長細(xì)胞的凋亡率低于二維對(duì)照組(見圖4、表1)，提示在BDM支架中hAMSCs的存活比例更高，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是hAMSCs在以BDM為支架的三維空間結(jié)構(gòu)中能形成更多的細(xì)胞間聯(lián)系，有利于細(xì)胞的存活，具體機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)目前已臻成熟，可用于三維培養(yǎng)的生物基質(zhì)材料有水凝膠、膠原、明膠、基質(zhì)膠等[14-17]，這些材料常被用于對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生化功能、遷移和基因表達(dá)等方面的研究[18-19]。有研究表明[20]，將生長狀態(tài)良好的P3 hAMSCs接種于自組納米短肽水凝膠中，然后對(duì)支架材料中的hAMSCs生長、增殖以及干性基因表達(dá)情況等進(jìn)行研究，結(jié)果顯示hAMSCs呈圓球形分散分布，干性基因表達(dá)上調(diào)，表明三維培養(yǎng)更有利于hAMSCs干性的維持；但增殖能力有所減弱，原因可能與水凝膠內(nèi)部多肽鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)。本研究實(shí)驗(yàn)組干細(xì)胞也展示了相似的生長特征，也證明了干細(xì)胞在三維與二維培養(yǎng)條件下確實(shí)存在異質(zhì)化的表現(xiàn)形式。

近年來有研究報(bào)道了人新鮮羊膜(Human fresh amniotic membrane, hFAM)宮腔移植在預(yù)防再粘連中的應(yīng)用，但療效不一，雖然對(duì)中、重度IUA患者TCRA術(shù)后粘連及月經(jīng)情況均在一定程度上得到了改善，但總體效果不佳[21-24]。主要原因在于單位面積內(nèi)hFAM內(nèi)hAMSCs含量較少，而干細(xì)胞的多少與內(nèi)膜修復(fù)效果直接相關(guān)[11,25-26]。本研究證明了hAMSCs在BDM中可以良好的存活，但AAM質(zhì)地呈近似“膠凍”狀，幾乎沒有韌性及抗拉能力，不能滿足下一步轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、尤其是后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能有兩個(gè)方面，一是含有DMEM/F12的細(xì)胞懸液對(duì)BDM的稀釋作用；二是BDM在與細(xì)胞懸液吹打混勻時(shí)在一定程度上破壞了其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。因此，想制備出能用于后續(xù)研究的AMM，須在確保AAM中hAMSCs數(shù)量和活性的前提下進(jìn)一步改良AMM，使其達(dá)到相應(yīng)的韌性及抗拉能力以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，目前，團(tuán)隊(duì)正在著手改進(jìn)AAM生物力學(xué)性能的研究。

本研究表明hAMSCs在以BDM為支架的人工羊膜中能夠存活，并具有良好的生物學(xué)活性，初步驗(yàn)證“人工羊膜”的設(shè)想是可行的。在后續(xù)研究中，我們將從生物材料及結(jié)構(gòu)組成上對(duì)AAM進(jìn)行改良，以增強(qiáng)AAM的生物力學(xué)性能，為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。