骨質(zhì)疏松病理微環(huán)境對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

胡松華，王乾興，路 建，鄭學(xué)玲，李 姣

(遵義醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

骨質(zhì)疏松是一種以骨量低下、骨的微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨的脆性增加、骨折易發(fā)的骨病[1]。促進(jìn)新骨形成被認(rèn)為是從根本上防治該病的有效策略。新骨形成來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)，而MSCs所參與的骨重建需在骨髓微環(huán)境內(nèi)進(jìn)行，骨髓微環(huán)境為其基礎(chǔ)[2]。即使骨髓微環(huán)境在病理狀態(tài)下，其對干細(xì)胞的增殖分化這兩大特性仍產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)影響[3]。骨質(zhì)疏松患者的骨髓微環(huán)境被改變[4-5]，極有可能影響了 MSCs 的正常生物學(xué)特性，導(dǎo)致其難以分化為成骨細(xì)胞，新骨形成受到抑制。前期研究中我們建立小鼠骨質(zhì)疏松病理模型，并在體外分離培養(yǎng)了模型組及對照組骨髓 MSCs。研究發(fā)現(xiàn)，模型組 MSCs 增殖能力及多向分化潛能均與對照組有明顯差異，表現(xiàn)為增殖能力下降，成骨細(xì)胞分化能力下降，但向脂肪分化能力增加[6]。這些研究結(jié)果提示長期處于病理微環(huán)境下的 MSCs 干性受到影響，難以發(fā)揮正常功能以對骨組織進(jìn)行修復(fù)，可能是骨質(zhì)疏松發(fā)病的關(guān)鍵原因。為進(jìn)一步明確病理骨髓微環(huán)境對 MSCs生物學(xué)特性的影響，本研究分離了模型組及對照組小鼠骨髓液，并用于處理體外培養(yǎng)的正常 MSCs，通過細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、多向分化等實(shí)驗(yàn)來檢測 MSCs生物學(xué)特性的改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料 清潔級雄性 C57BL6/J 小鼠( 8周齡16 只、4周齡8只)，體質(zhì)量 20～25g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司[許可證號 SYXK(滬)2018-0062]。DMEM低糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)均購自 Hyclone 公司；β-磷酸甘油、抗壞血酸、胰島素、Dex、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、油紅 O、茜素紅均購自 Sigma公司；CKK-8 檢測試劑盒及 TUNEL 染色試劑盒購自碧云天公司；抗 Osx(ab209484，兔源)、Runx2(ab23981，兔源)、C/EBPα (ab15048，兔源)抗體購自Abcam 公司；抗 PPARγ (2435，兔源) 抗體、HRP 標(biāo)記抗兔 IgG 二抗(7074)購自 Cell Signal Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 C57BL/6J小鼠(雄性、8周齡)正常飼養(yǎng) 1 周后隨機(jī)分為兩組，每組 8 只。骨質(zhì)疏松模型組(OP 組)：按 50 mg/kg 體質(zhì)量皮下注射 Dex；對照組(NC 組)：注射同等劑量生理鹽水。OP 組及 NC 組小鼠每天注射 1 次，持續(xù) 5 周。小鼠處死后剝離右側(cè)股骨及脛骨，除去結(jié)締組織，以4%多聚甲醛固定12 h后，于12.5% EDTA溶液中脫鈣3周，每3天更換1次脫鈣液。脫鈣結(jié)束后的骨組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(H&E)染色、拍照，并以ImageJ軟件對骨小梁平均厚度(Tb.Th)、骨小梁面積(Tb.A)及骨小梁數(shù)目(Tb.N)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，OP組骨小梁相關(guān)指標(biāo)顯著下降則說明骨質(zhì)疏松模型成功建立。

1.2.2 骨質(zhì)疏松骨髓液收集 OP組及NC組小鼠左側(cè)后肢骨用于收集骨髓液。無菌環(huán)境下取左側(cè)股骨及脛骨，剝離結(jié)締組織，以無菌PBS漂洗3次。剪去骨骺兩端后用無菌注射器取5 mL DMEM 低糖培養(yǎng)基沖出骨髓，以離心管收集后，1 000 rpm離心10 min除去骨髓細(xì)胞，收集上清再經(jīng)10 000 rpm離心30 min除去細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，收集上清骨髓液，與正常培養(yǎng)基1∶1混合用于處理細(xì)胞。

1.2.3 MSCs體外培養(yǎng)及分化 另取正常C57BL/6J小鼠(8只，雄性，4周齡)處死后于75%乙醇中消毒10 min ，無菌環(huán)境下取左側(cè)后肢骨，剪去骨骺兩端后用 5 mL 無菌注射器取 DMEM 低糖培養(yǎng)基沖出骨髓細(xì)胞，裂解紅細(xì)胞后收集細(xì)胞并接種于含有 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞傳代3次后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測 采用 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖情況。傳代3次后的 MSCs 按5×103個/孔接種96孔板，并設(shè)置5個復(fù)孔。接種12 h細(xì)胞貼壁后更換為含有骨髓液的培養(yǎng)基，并計(jì)時(shí)為 0，繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48、60 h。每孔加入 CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h后，以Tecan Infinite F200 多功能酶標(biāo)儀檢測吸光度值(D450)，并繪制增殖曲線。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測 取第 4 代 MSCs 以 1×104個/mL 的密度制作細(xì)胞爬片，貼壁培養(yǎng)12 h后更換為含有骨髓液的培養(yǎng)基，計(jì)時(shí)為0，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h。細(xì)胞經(jīng) 4%多聚甲醛固定，進(jìn)行 TUNEL 染色(參照說明書進(jìn)行)。以Hoechst 33258處理樣本10 min對細(xì)胞核進(jìn)行染色，PBS洗3次后封片，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取3個視野計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) MSCs接種6孔板，貼壁12 h后更換含有骨髓液的培養(yǎng)基，并培養(yǎng)至100%匯合。以無菌牙簽在細(xì)胞層上劃線，PBS洗3次繼續(xù)在含骨髓液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。顯微鏡下觀察培養(yǎng)前及培養(yǎng)后劃痕的寬度及愈合情況。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn) MSCs接種于24孔Transwell培養(yǎng)板(孔徑8 nm)的上層小室，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，更換含有骨髓液的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。上層小室內(nèi)的細(xì)胞以棉棒擦除，遷移至膜另一側(cè)的細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取 3 個視野統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 細(xì)胞分化誘導(dǎo) 成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)：細(xì)胞以 1×104個/mL的密度接種6孔板，貼壁培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)液為成骨誘導(dǎo)液(DMEM 高糖培養(yǎng)基含10%FBS、50 μmol/L 抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油和 0.1 μmol/L 地塞米松)，同時(shí)添加OP及NC組骨髓液，連續(xù)培養(yǎng)21 d，每3天更換1次含骨髓液的成骨誘導(dǎo)液。脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)：細(xì)胞以 1×105個/mL 的密度接種 6 孔板，貼壁培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)液成脂誘導(dǎo)液(DMEM 高糖培養(yǎng)基含10 μg/mL 胰島素,10% FBS,0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，10 μmol/L地塞米松)，同時(shí)添加OP組及NC組骨髓液，連續(xù)培養(yǎng)8 d，每3天更換一次含有骨髓液的誘導(dǎo)液。

1.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime PCR) 采用Trizol法提取細(xì)胞總 RNA。取 1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，并以雙蒸水稀釋 10 倍后作為 Realtime PCR 的模板。擴(kuò)增引物序列見表1。擴(kuò)增反應(yīng)在 Roche LightCycler480 上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min，94℃ 10 s，60℃ 20 s，40個循環(huán)加溶解曲線分析 。擴(kuò)增產(chǎn)物以β-actin作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化，以2-△△ Ct法計(jì)算基因表達(dá)量增加倍數(shù)。

表1 Realtime PCR引物序列

基因名稱引物序列擴(kuò)增片段長度Col1a1Forward: 5′- GAAGTCAGCTGCATACAC-3′Reverse: 5′-AGGAAGTCCAGGCTGTCC-3′312 bpOsxForward: 5′-TGGGAACAAGAGTGAGCTGG-3′Reverse: 5′-GTGAGCTTCTTCCTGGGTAGG-3′141 bpaP2Forward: 5′-AAATCACCGCAGACGACA-3′Reverse: 5′-CACATTCCACCACCAGCT-3′138 bpGlut4Forward: 5′-CTTGGCTCCCTTCAGTTTG-3′Reverse: 5′-TGCCTTGTGGGATGGAAT-3′130 bpβ-actinForward: 5′-CCCTGTATGCCTCTGGTCReverse: 5′-GTCTTTACGGATGTCAACG455 bp

1.2.10 Western blot 細(xì)胞以RIPA裂解液(含10% PMSF)冰上裂解30 min后，收集裂解液，并以12 000 rpm 離心10 min 收集上清總蛋白。總蛋白濃度以 BCA 法測 定 。 各 樣 本 取 50 μg 蛋 白 進(jìn) 行 十 二 烷 基 硫 酸 鈉 - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳(SDS-PAGE)。蛋白轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜后，5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h后，分別加入一抗：Runx2、Osterix、C/EBPα、PPARγ以及內(nèi)參β-actin(1∶10 000稀釋)，4℃孵育過夜。次日洗膜3次后加入二抗(1∶10 000 稀釋)室溫孵育2 h，洗膜3次后采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的增強(qiáng)性化學(xué)發(fā)光法顯色，X 膠片感光。

1.2.11 茜素紅染色 細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)21 d后，經(jīng)70%乙醇固定1 h，雙蒸水洗3次后加入40 mM茜素紅染色液染色15 min，雙蒸水洗5次后顯微觀察。

1.2.12 油紅O染色 細(xì)胞脂肪誘導(dǎo)8 d后，吸棄培養(yǎng)液，以3.7%的中性甲醛固定10 min后，加入0.5%油紅O染色1 h，多余染色液經(jīng)70%乙醇漂洗后顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以SPSS 17.0進(jìn)行，采用配對樣本Student’st檢驗(yàn)比較組間差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為 0.05。圖像定量分析采用ImageJ 1.8.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松病理骨髓液抑制MSCs增殖 前期研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松模型組骨髓MSCs的增殖能力及成骨分化能力和正常MSCs相比明顯下降，推測病理骨髓微環(huán)境改變了MSCs的生物學(xué)特性[6]。為進(jìn)一步明確病理微環(huán)境對MSCs的影響，本研究利用糖皮質(zhì)激素處理建立小鼠骨質(zhì)疏松病理模型。骨組織學(xué)檢測結(jié)果顯示，與對照組(NC組)相比，模型組(OP組)小鼠有明顯骨丟失表型(見圖1)。骨計(jì)量學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)OP組小鼠骨小梁面積百分比(Tb.A)、骨小梁平均厚度(Tb.Th)以及骨小梁數(shù)目均顯著低于對照(見表2)，說明模型建立成功。分別收集OP組及NC組骨髓液，用于處理體外正常培養(yǎng)的MSCs。結(jié)果顯示，OP組骨髓液處理下MSCs增殖能力明顯下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2)。

圖1 NC組及OP組小鼠骨組織學(xué)形態(tài)

組別Tb.Th (mm)Tb.A (%)Tb.N (mm-1)NC0.053±0.00437.63±4.675.73±0.42OP0.026±0.003?14.85±2.19?3.87±0.22?

* ：P<0.05 vs NC 組,n=8。

* ：P<0.05 vs NC組,**：P<0.01vs NC組，n=3。圖2 OP組及NC組骨髓液對MSCs增殖能力的影響

2.2 骨質(zhì)疏松病理骨髓液促進(jìn)MSCs凋亡 通過TUNEL染色檢測OP組及NC組骨髓液處理MSCs后的凋亡情況。結(jié)果顯示，OP組骨髓液處理MSCs 24 h后顯著增加細(xì)胞凋亡，且凋亡細(xì)胞數(shù)量隨處理時(shí)間的增加而增加，與NC組MSCs凋亡數(shù)量有差異，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖 3)。

* ：P<0.05 vs NC組,**：P<0.01vs NC組，n=3。圖3 OP組及NC組骨髓液對MSCs凋亡的影響

2.3 骨質(zhì)疏松病理骨髓液抑制MSCs 遷移 通過劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測在不同微環(huán)境下MSCs的體外遷移能力是否發(fā)生改變。結(jié)果顯示，OP組骨髓液所帶來的病理微環(huán)境下，MSCs遷移能力明顯下降(見圖 4A)，遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少(見圖4B)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4C)。

A：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測MSCs遷移能力；B：transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力；C：transwell 遷移細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)；*：P<0.05 vs NC組,n=3。圖4 OP組及NC組骨髓液對MSCs遷移的影響

2.4 骨質(zhì)疏松病理骨髓液抑制MSCs成骨分化 在OP組及NC組骨髓液處理下，對MSCs進(jìn)行為期21 d的成骨分化誘導(dǎo)。Realtime PCR結(jié)果顯示NC組骨髓液處理下MSCs分化過程中高表達(dá)成骨分化基因OSX及Cola1，但OP組骨髓液處理下Osx及Colla1的表達(dá)量明顯低于NC組，在分化7 d和14 d時(shí)最為顯著(見圖5A)。分化21 d后茜素紅染色發(fā)現(xiàn)OP組骨髓液處理下礦化小結(jié)形成顯著少于NC組(見圖5B)。這些結(jié)果說明OP組骨髓液抑制了MSCs的成骨分化。

A：成骨分化誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)相關(guān)基因表達(dá)量檢測；B：成骨分化誘導(dǎo)21 d后茜素紅染色；*：P<0.05 vs NC組,n=3。圖5 OP組及NC組骨髓液對MSCs成骨分化的影響

2.5 骨質(zhì)疏松病理骨髓液促進(jìn)MSCs成脂分化 在OP組及對NC組骨髓液處理下，對MSCs進(jìn)行為期8 d的成脂分化誘導(dǎo)。Realtime PCR結(jié)果顯示OP組骨髓液處理下的MSCs高表達(dá)脂肪分化相關(guān)基因aP2及Glut4,其表達(dá)量顯著高于NC組(見圖6A)。油紅O染色顯示脂滴形成增加(見圖6B)。這些結(jié)果說明OP組骨髓液促進(jìn)MSCs分化為脂肪細(xì)胞。

A：脂肪誘導(dǎo)過程中相關(guān)基因表達(dá)水平檢測；B：脂肪誘導(dǎo)8天后油紅O染色；*：P<0.05 vs NC組，**：P<0.01 vs NC組,n=3。圖6 OP組及NC組骨髓液對MSCs脂肪分化的影響

2.6 骨質(zhì)疏松病理骨髓液影響MSCs分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá) 采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測OP組及NC組骨髓液處理下MSCs分化過程中成骨及脂肪分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)分化7 d后，NC組骨髓液處理下的MSCs高表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2及Osx；而OP組骨髓液處理下二者表達(dá)量明顯低于NC組(見圖7A)。相反，OP組骨髓液處理下能促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化過程中轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα及PPARγ的表達(dá)(見圖7A)。表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖7B)。

A：Western blot 檢測相關(guān)因子蛋白水平；B：Western blot 定量分析；*：P<0.05 vs NC組，**：P<0.01 vs NC組,n=3。圖7 對MSCs成骨分化及脂肪分化過程中 OP 組及 NC 組骨髓液對相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響

3 討論

目前，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率逐年升高。臨床上對該病的主要治療方法集中為通過藥物抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收[7]。抑制骨吸收雖然能阻止骨組織被進(jìn)一步破壞，但卻無法促進(jìn)新骨形成以修復(fù)已經(jīng)受損的骨組織。因此促進(jìn)新骨形成才是從根本上治療此類疾病的關(guān)鍵[8]。骨形成依賴于骨髓中的MSCs。但臨床及動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松者骨髓 MSCs 難以分化為成骨細(xì)胞，反而易分化為脂肪細(xì)胞[9-12]，說明 MSCs 分化潛能被改變。我們的前期研究中全面分析了骨質(zhì)疏松病理狀態(tài)下 MSC 的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)與正常 MSCs 相比，骨質(zhì)疏松 MSCs 增殖能力及向成骨細(xì)胞分化能力下降[6]。這些結(jié)果提示長期處于骨質(zhì)疏松病理骨髓微環(huán)境下的 MSCs 受到病理微環(huán)境的影響，生物學(xué)特性被改變，難以分化為成骨細(xì)胞來補(bǔ)充被吸收的骨組織。因此，本研究通過收集骨質(zhì)疏松小鼠骨髓液，用于體外模擬病理骨髓微環(huán)境，進(jìn)一步探討病理微環(huán)境下 MSCs 生物學(xué)特性的改變及其分子機(jī)制。

干細(xì)胞基本生物學(xué)特性包括自我更新、增殖能力及分化為至少一種體細(xì)胞的能力。本研究中發(fā)現(xiàn)處于病理骨髓微環(huán)境下的 MSCs 增殖能力明顯下降。這一發(fā)現(xiàn)與我們前期研究結(jié)果一致[6]，提示病理骨髓微環(huán)境抑制 MSCs 增殖，使得 MSCs無法自我更新。此外，我們還發(fā)現(xiàn)病理微環(huán)境下細(xì)胞凋亡增加。由此可推測，病理微環(huán)境下的 MSCs 難以自我更新，同時(shí)易凋亡，導(dǎo)致其本身數(shù)量逐漸減少。骨髓中干細(xì)胞耗竭使得被吸收的骨組織難以修復(fù)，可能是導(dǎo)致骨丟失的關(guān)鍵原因之一。值得注意的是，前期研究中我們從骨質(zhì)疏松模型小鼠中分離的 MSCs 在體外培養(yǎng)時(shí)并未發(fā)現(xiàn)凋亡水平增加[6]，提示離開病理微環(huán)境后 MSCs 不再凋亡，進(jìn)一步證明病理骨髓微環(huán)境對 MSCs 凋亡有重要的影響。病理骨髓微環(huán)境以慢性炎癥及氧化應(yīng)激為特點(diǎn)[4,10]，炎癥因子 TNF-α、IL-1 以及氧自由基含量增加，這些因子都能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。而 MSCs 脫離病理微環(huán)境后，在體外正常培養(yǎng)時(shí)凋亡不再發(fā)生，但增殖能力仍未能得到恢復(fù)，其中分子機(jī)理需要進(jìn)一步的研究。

MSCs 在體內(nèi)修復(fù)骨組織的第一步是感受到骨吸收時(shí)釋放到骨髓腔中的趨化因子，并跟隨趨化因子的濃度梯度向骨吸收表面遷移，然后再在骨表面分化為成骨細(xì)胞，以此形成骨吸收與骨形成的精確偶聯(lián)[14]。因而 MSCs 的遷移能力也是影響體內(nèi)骨形成一個關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)病理骨髓液抑制 MSCs 遷移，提示在體內(nèi)病理骨髓微環(huán)境中，MSCs 難以向骨形成表面遷移，可能同樣是導(dǎo)致骨形成下降的關(guān)鍵因素之一。

MSCs 具有多向分化潛能，能分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞及軟骨細(xì)胞。其中成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞分化存在一種競爭性的平衡關(guān)系[6]。骨質(zhì)疏松患者骨髓腔中出現(xiàn)大量的脂肪組織，提示在病理微環(huán)境下 MSCs 分化平衡被破壞，易成脂而難成骨。本研究在骨質(zhì)疏松骨髓液處理下對 MSCs 進(jìn)行為期 21d 的成骨分化誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照相比 MSCs 難以分化為成骨細(xì)胞，相關(guān)基因表達(dá)下降，且形成的礦化小結(jié)明顯減少。相反，病理微環(huán)境下 MSCs 更容易分化為脂肪細(xì)胞。前期研究中發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松小鼠 MSCs 的成骨成脂分化平衡被破壞[5]，本研究確證了其分化潛能改變是受到病理骨髓微環(huán)境的影響。MSCs 的分化命運(yùn)是由幾個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子來決定的。這些轉(zhuǎn)錄因子一旦表達(dá)后，就能驅(qū)動分化相關(guān)基因的表達(dá)，從而啟動細(xì)胞分化。為進(jìn)一步探索病理微環(huán)境影響對 MSCs 分化潛能的機(jī)制，我們檢測了成骨分化及脂肪分化中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)改變情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)病理骨髓液能抑制成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子 Runx2 及 Osx 的表達(dá)，而高表達(dá)脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子 C/EBPα及 PPARγ。這些結(jié)果說明病理微環(huán)境能影響MSCs 分化過程中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，及有可能是導(dǎo)致 MSCs 分化潛能改變的關(guān)鍵原因。

綜上所述，骨質(zhì)疏松時(shí)骨髓微環(huán)境發(fā)生病理改變，而骨髓微環(huán)境作為 MSCs 增殖分化等功能發(fā)揮作用的外部條件[15]，其病理微環(huán)境改變將對體內(nèi)殘存正常 MSCs的分化功能產(chǎn)生病理影響，主要表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松病理骨髓微環(huán)境抑制 MSCs 增殖和遷移，促進(jìn)其凋亡，同時(shí)改變了 MSCs 的分化潛能。以上影響均導(dǎo)致骨質(zhì)疏松時(shí)正常 MSCs 難以分化為成骨細(xì)胞來修復(fù)受損骨組織，導(dǎo)致骨重建遭到破壞。這些結(jié)果提示，通過藥物改善病理骨髓微環(huán)境，激活自身 MSCs 活性可能是防治骨質(zhì)疏松的有效方法之一。