淫羊藿次苷Ⅱ通過上調(diào)PPARα/γ改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥大

林小英，曾凡群，付 舒，任星橋，李葉麗，楊丹莉

(遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室暨遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

心肌肥大是高血壓的常見并發(fā)癥，是多種心血管疾病發(fā)生率與病死率升高的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。病理性心肌肥大的持續(xù)存在會(huì)導(dǎo)致心律失常和心力衰竭，引發(fā)猝死[1]。過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，是核激素受體超家族成員之一，有PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三種亞型。PPARs參與脂質(zhì)和能量的代謝以及炎癥的調(diào)節(jié)，是心肌肥大的重要調(diào)節(jié)因子[2]。自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats,SHR)的高血壓并發(fā)癥與人類相似，隨著周齡的增加SHR會(huì)出現(xiàn)心肌肥大，并且在高血壓病程中SHR的心肌肥大會(huì)持續(xù)存在[3-4]。

淫羊藿次苷Ⅱ(icarisideⅡ,ICS Ⅱ)作為一種多羥基黃酮類單體，是中國傳統(tǒng)益補(bǔ)中藥淫羊藿的主要活性成分之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ICS Ⅱ具有降低血壓、改善心肌纖維化以及抑制心肌細(xì)胞凋亡等多種心血管保護(hù)作用[5- 6]。故推測(cè)，ICS Ⅱ可能通過PPARs改善心肌肥大。因此，本研究以SHR為研究對(duì)象，旨在觀察ICS Ⅱ?qū)HR心肌肥大的影響，并初步探討其作用機(jī)制是否與PPARs的表達(dá)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 淫羊藿次苷II(純度≥98%，批號(hào)：FY17460602，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；BCA法蛋白定量試劑盒(貨號(hào)：GK5012，上海捷瑞生物工程有限公司)；PageRuler Prestained Protein Ladder(貨號(hào)：26617，Thermo Scientific公司)；PPARα兔抗大鼠抗體、PPARγ兔抗大鼠抗體、GAPDH兔抗大鼠抗體(貨號(hào)：15540-1-AP、16643-1-AP、10494-1-AP，Proteintech公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號(hào)：S0001，Affinity公司)；High-sig ECL Western Blotting Substrate(貨號(hào)：180-501，Tanon公司)。

1.2 儀器 制冰機(jī)(日本三洋公司)；RM2245組織切片機(jī)(德國Leica Biosystems公司)；BX43顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；5427R離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Mini-Protean3電泳儀、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、ChemiDoc 成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 13周齡的雄性SHR 21只以及同齡雄性WKY 7只，均為無特定病原體(Specific pathogen-free,SPF)級(jí)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。經(jīng)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，以WKY作為空白對(duì)照組(WKY組,n=7)，將SHR隨機(jī)分為模型組(SHR組,n=7)、ICS Ⅱ 4 mg/kg劑量組(ICS II-L組,n=7)和ICS Ⅱ 16 mg/kg劑量組(ICS Ⅱ-H組,n=7)。ICS II-L和ICS II-H組大鼠每日灌胃ICS II混懸液一次至26周齡，同時(shí)SHR和WKY組大鼠灌胃等體積雙蒸水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 計(jì)算大鼠左心室質(zhì)量指數(shù) 給藥12周后，將大鼠禁食12 h稱體重，腹腔注射2%戊巴比妥(2 mL/kg)，迅速用手術(shù)剪打開大鼠胸腔取出心臟，去除血管及其它多余組織后用預(yù)冷的生理鹽水洗去心臟內(nèi)外殘留血液，濾紙吸干后分離大鼠左心室保留室間隔稱重，計(jì)算大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)。大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)=大鼠左心室質(zhì)量(mg)/大鼠體重(g)。

1.4.2 H&E染色 在近心尖5 mm處取約3 mm厚的大鼠左心室組織，4%甲醛溶液固定組織48 h，脫水，石蠟包埋，組織切片機(jī)切片后進(jìn)行H&E染色，用正置顯微鏡觀察大鼠左心室組織病理學(xué)變化。

1.4.3 蛋白免疫印跡法檢測(cè)大鼠左心室組織PPARα和PPARγ的蛋白水平 分別稱取大鼠左心室組織約100 mg，將組織剪碎后加入1 mL RIPA 裂解液與10 μL PMSF溶液，使用高速勻漿器在冰上進(jìn)行組織勻漿，靜置30 min，4℃、12 000 rpm離心15 min，取上清液。BCA法測(cè)定上清液的蛋白含量，使用8%分離膠和5%濃縮膠配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣30 μg蛋白電泳，用轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5 %脫脂牛奶室溫封閉3 h，TBST洗膜10 min×3次，4℃過夜孵育一抗：PPARα(1∶100 0)、PPARγ(1∶100 0)、GAPDH(1∶200 00)，TBST洗膜10 min×3次，室溫孵育山羊抗兔IgG(1∶6 000)1 h，TBST洗膜10 min×3次，高敏ECL化學(xué)發(fā)光顯色，ChemiDoc成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖像。

2 結(jié)果

2.1 大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)變化 與WKY組相比，SHR組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)升高32.5%(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ-H組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)降低15.2%(P<0.05)，見圖1。

#：vs WKY，P<0.05； *：vs SHR，P<0.05；n =5。圖1 ICS Ⅱ?qū)Υ笫笞笮氖屹|(zhì)量指數(shù)的影響

2.2 大鼠左心室組織病理學(xué)變化 H&E染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WKY組心肌細(xì)胞排列致密有序；SHR組心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維斷裂、溶解，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞橫徑及細(xì)胞間隙增大，心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯肥大；ICS Ⅱ-L組上述病理現(xiàn)象無明顯改善；ICS Ⅱ-H組心肌纖維排列趨于整齊，斷裂和溶解現(xiàn)象改善，細(xì)胞橫徑及細(xì)胞間隙減小，心肌細(xì)胞肥大明顯改善,見圖2。

標(biāo)尺: 50 μm,放大倍數(shù): ×400。圖2 大鼠左心室H&E染色結(jié)果

2.3 ICS Ⅱ?qū)Υ笫笞笮氖医M織PPARα蛋白表達(dá)的影響 與WKY組相比，SHR組大鼠左心室PPARα蛋白表達(dá)下調(diào)29.1%(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ-H組大鼠左心室PPARα蛋白表達(dá)上調(diào)42.7%(P<0.05)，見圖3。

2.4 ICS Ⅱ?qū)Υ笫笞笮氖医M織PPARγ蛋白表達(dá)的影響 與WKY組相比，SHR組大鼠左心室PPARγ蛋白表達(dá)下調(diào)24.7%(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ-H組大鼠左心室PPARγ蛋白表達(dá)上調(diào)30.3%(P<0.05)，見圖4。

#： vs WKY，P<0.05；*： vs SHR，P<0.05；n=4。圖3 ICS Ⅱ?qū)Υ笫笞笮氖襊PARα表達(dá)的影響

# ：vs WKY，P<0.05；* ：vs SHR，P<0.05;n=4。圖4 ICS Ⅱ?qū)Υ笫笞笮氖襊PARγ表達(dá)的影響

3 討論

心肌肥大是心臟對(duì)壓力超負(fù)荷的適應(yīng)性反應(yīng)，表現(xiàn)為心肌質(zhì)量的增加和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，分為生理性心肌肥大和病理性心肌肥大[7]。生理性心肌肥大常見于運(yùn)動(dòng)員，可以增強(qiáng)心臟的功能而不損傷心臟。病理性心肌肥大常在高血壓、心肌梗塞和主動(dòng)脈狹窄等患者中出現(xiàn)。病理性心肌肥大在代償期可以增強(qiáng)心臟的收縮和泵血功能，但持續(xù)的病理性心肌肥大會(huì)造成心肌功能減退，導(dǎo)致心力衰竭和心律失常，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)猝死[1]。

ICS Ⅱ作為中藥淫羊藿的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老以及抑制炎癥反應(yīng)等作用[8-9]。研究表明，ICS Ⅱ能夠減輕SHR的高血壓心臟病、改善糖尿病大鼠的心肌病、逆轉(zhuǎn)主動(dòng)脈狹窄小鼠的心室重構(gòu)[10-12]。ICS Ⅱ具有良好的心血管保護(hù)作用，但I(xiàn)CS Ⅱ?qū)HR心肌肥大的作用及其具體機(jī)制尚需深入研究。本研究結(jié)果顯示，ICS Ⅱ能夠改善SHR左心室質(zhì)量指數(shù)，改善SHR左心室心肌纖維排列紊亂、部分肌絲斷裂與溶解以及心肌細(xì)胞橫徑與細(xì)胞間隙增大的病理變化，確證ICS Ⅱ具有改善SHR心肌肥大的作用。

PPARs有PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三種亞型。在心肌組織中，激活PPARα能夠使脂肪酸氧化關(guān)鍵酶基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)脂肪酸氧化，從而改善心肌細(xì)胞的脂質(zhì)代謝和能量調(diào)節(jié)；PPARγ同樣能夠通過參與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控，調(diào)節(jié)脂肪的儲(chǔ)存和分解維持機(jī)體能量的平衡[2]。心肌組織是機(jī)體能量消耗最多的組織，脂質(zhì)代謝和能量調(diào)節(jié)對(duì)心肌疾病的防治至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B能夠上調(diào)PPARα的表達(dá)抑制糖尿病小鼠的心肌肥大[13]；姜黃素可以通過活化PPARγ/Akt/NO信號(hào)通路改善高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大[14]；PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮可以改善糖尿病大鼠的心肌肥大[15]。因此，PPARα和PPARγ作為脂肪酸氧化酶的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可能通過參與心肌細(xì)胞的脂質(zhì)代謝和能量調(diào)節(jié)，影響病理性心肌肥大的發(fā)生與發(fā)展[16]。本研究結(jié)果顯示，與WKY組相比，SHR組大鼠左心室PPARα和PPARγ蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，提示在SHR模型中PPARα/γ信號(hào)通路被抑制。與SHR組相比，ICS Ⅱ-H組大鼠左心室組織PPARα和PPARγ蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，顯示ICS Ⅱ能夠抑制SHR左心室PPARα和PPARγ蛋白表達(dá)下調(diào)，提示ICS Ⅱ可能通過上調(diào)PPARα/γ信號(hào)通路改善SHR心肌肥大。