硫氰酸紅霉素原位殺藻的生態(tài)學(xué)效應(yīng)

王雪瑩，畢相東*, 董少杰，尤宏爭，劉克明，戴偉, 李宛津

(1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津300384；2.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221)

長期以來，以銅綠微囊藻Microcystisaeruginosa為主體的藍(lán)藻水華給淡水養(yǎng)殖造成了巨大危害，已成為限制淡水養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要瓶頸之一[1-2]，尤其是對缺水較為嚴(yán)重的北方地區(qū)淡水養(yǎng)殖業(yè)危害更大[3]。自然狀態(tài)下，微囊藻包括產(chǎn)毒微囊藻和非產(chǎn)毒微囊藻兩種生態(tài)型，產(chǎn)毒微囊藻可產(chǎn)生一類化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的原發(fā)性肝癌毒素——微囊藻毒素(Microcystins，簡稱MCs)[4]，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1，其中以MC-LR和MC-RR兩種異構(gòu)體最為常見且毒性較大[5]。產(chǎn)毒微囊藻正常生長過程中MCs主要儲積于藻細(xì)胞內(nèi)[6]，藻細(xì)胞死亡后胞內(nèi)毒素就會釋放至水體中[7]。藍(lán)藻水華暴發(fā)盛期，水體中MCs含量最高可達(dá)到10 μg/L[8]。MCs對水生動物有較強的毒害作用，可以顯著抑制其胚胎發(fā)育、生長及繁殖，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致其大規(guī)模死亡[9-10]，同時儲積在養(yǎng)殖動物體內(nèi)的MCs又威脅著水產(chǎn)品質(zhì)量安全[11]，造成淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟效益嚴(yán)重受損，故實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中多會使用殺藻劑應(yīng)急抑殺藍(lán)藻。

以往養(yǎng)殖生產(chǎn)中，采用硫酸銅或螯合銅應(yīng)急抑殺水華藍(lán)藻效果雖佳，但極易造成養(yǎng)殖水域重金屬離子的二次污染，由此不僅對養(yǎng)殖動物生存造成嚴(yán)重脅迫，還威脅著水產(chǎn)品質(zhì)量安全[12]。

硫氰酸紅霉素(Erythromycin thiocyanate)對細(xì)菌等原核生物具有很好的抑殺效應(yīng)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中已廣泛使用[13-14]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。已有研究表明，當(dāng)硫氰酸紅霉素含量大于10 μg/L時，水體中微囊藻細(xì)胞受到明顯損傷[15-16]。因此，若在養(yǎng)殖生產(chǎn)中采用硫氰酸紅霉素應(yīng)急抑殺藍(lán)藻可能會造成藍(lán)藻大量死亡，而短時間內(nèi)大量釋放出來的MCs嚴(yán)重威脅著養(yǎng)殖魚類的存活。底泥界面是MCs主要歸趨場所[17]，在受到攪動及水化學(xué)指標(biāo)變化時[18]，沉積于底泥中MCs又會被釋放至上覆水中[19]，因此，明確底泥表層MCs含量將對評估養(yǎng)殖水體中MCs含量及其危害具有重要意義。

本研究中，擬以硫氰酸紅霉素作為應(yīng)急殺藻劑，開展硫氰酸紅霉素原位殺藻的生態(tài)學(xué)效應(yīng)研究，分析硫氰酸紅霉素作用下生態(tài)圍隔內(nèi)的藍(lán)藻豐度、底泥MCs含量及關(guān)鍵水化學(xué)指標(biāo)的動態(tài)變化規(guī)律，以期摸索出兼顧殺藻效果與MCs釋放量的最優(yōu)殺藻技術(shù)流程，這將對科學(xué)使用殺藻劑及避免由殺藍(lán)藻所誘發(fā)的MCs對養(yǎng)殖動物的危害具有非常重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選址在常年頻繁暴發(fā)藍(lán)藻的淡水魚類養(yǎng)殖尾水循環(huán)渠中，以高密度不透水帆布為分隔材料、以不銹鋼鐵架和鋼管為支架，搭建底面直徑1.2 m、高2 m的圓柱體生態(tài)圍隔，生態(tài)圍隔上面高出水面20～30 cm，下部伸入到底泥，試驗共建立15個生態(tài)圍隔(圖2)。

硫氰酸紅霉素(分析純)購自天津鼎正藥業(yè)公司，MC-RR、MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品為白色粉末，純度為95%；三氟乙酸(分析純)購自濟南化工科技公司。

1.2 方法

1.2.3 微囊藻毒素的測定

(1)微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。標(biāo)準(zhǔn)品MC-RR、MC-LR母液的制備參照國標(biāo)法(GB/T 20466—2006)[22]，取適量母液加超純水稀釋成濃度為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL。使用安捷倫 1260 Infinity II 高效液相色譜儀測定峰面積及確定每種毒素的出峰時間。測定條件為：進樣量20 μL，色譜柱溫為40 ℃，紫外可見光檢測器波長為238 nm，流動相為0.05%三氟乙酸和60%甲醇(色譜純)。

(2)底泥樣品采集及微囊藻毒素的萃取。底泥中MCs測定方法參照樊潔等[23]的方法。使用彼得遜采泥器取表層底泥沉積物，冷凍后帶回實驗室。于-80 ℃下反復(fù)凍融5次后混勻、真空凍干，用90%的甲醇反復(fù)萃取3次，取上清液減壓蒸發(fā)濃縮，采用預(yù)先活化的C18小柱進行毒素的富集，用20%甲醇溶液淋洗，再用含0.1%三氟乙酸的甲醇溶液洗脫，洗脫液在40 ℃減壓濃縮至近干，用甲醇溶液定容至1 mL，過0.22 μm微孔濾膜后進行HPLC檢測，檢測條件同(1)。

(3)微囊藻毒素回收率的測定?；厥章适窃u價MCs萃取過程中的一個重要指標(biāo)，測定方法采用加標(biāo)-回收法，具體為在適量底泥樣品中加入0.1 mL毒素標(biāo)準(zhǔn)品(MC-RR和MC-LR)充分混勻，隨后按照(2)中的方法測定微囊藻毒素濃度?；厥章视嬎愎饺缦拢?/p>

底泥回收率=(加標(biāo)底泥樣品測定值-底泥樣品測定值)/加標(biāo)量×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，用LSD法進行組間多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫氰酸紅霉素作用下生態(tài)圍隔中藍(lán)藻及微囊藻豐度與生物量的動態(tài)變化規(guī)律

試驗期間圍隔中出現(xiàn)10個屬(種)的藍(lán)藻，分別為微囊藻Microcystis、細(xì)小平裂藻Merismopediaminima、色球藻Chroococcusminutus、顫藻Oscillatoriasp.、優(yōu)美平裂藻Merismopediaelegans、席藻Phormidiumsp.、尖頭藻Raphidiopsissp.、隱球藻Aphanocapsasp.、螺旋藻Spirulinasp.。

從圖3可見：硫氰酸紅霉素對藍(lán)藻有較強的殺滅作用，且呈現(xiàn)出明顯的濃度效應(yīng)，試驗結(jié)束時，所有硫氰酸紅霉素處理組對藍(lán)藻殺滅率均達(dá)99%以上；微囊藻的豐度和生物量與藍(lán)藻的變化趨勢相似，到試驗結(jié)束時，硫氰酸紅霉素作用下微囊藻豐度為(0～1.32)×106cells/L，生物量為0～0.66 mg/L。整體上來看，在滿足殺藻效果基礎(chǔ)上，濃度為0.25、0.5 mg/L的硫氰酸紅霉素殺藻性能相對緩和些。

2.2 硫氰酸紅霉素作用下底泥中MCs含量的動態(tài)變化規(guī)律

微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品MC-RR與MC-LR濃度與對應(yīng)峰面積的線性回歸方程分別為y=23.872x-7.6868(R2=0.999)和y=26.741x+2.9529(相關(guān)系數(shù)R2=0.999)，均顯示出良好的線性關(guān)系，且有較寬的微囊藻毒素濃度檢測范圍。進一步檢測表明，本研究中底泥MC-RR和MC-LR的萃取回收率分別為16.8%和30.1%。

從圖4可見：在硫氰酸紅霉素作用下，底泥中MC-RR和MC-LR含量均呈現(xiàn)短時間內(nèi)(2 d)有明顯升高趨勢，其中MC-LR含量增高趨勢較MC-RR明顯，MC-RR和MC-LR含量最高時分別達(dá)(2.58±0.99)、(3.39±0.23)μg/g；隨后多數(shù)硫氰酸紅霉素處理組MC-RR和MC-LR含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢，直至試驗結(jié)束時，MCs仍高于對照組；結(jié)合藍(lán)藻及微囊藻豐度動態(tài)變化規(guī)律可知，在硫氰酸紅霉素作用下短時間內(nèi)藻細(xì)胞大量破裂死亡，釋放出來的藻毒素大量儲積在底泥表層沉積物中。依據(jù)硫氰酸紅霉素作用下底泥表層沉積物中MCs含量變化規(guī)律，建議采用≤0.25 mg/L硫氰酸紅霉素應(yīng)急殺滅藍(lán)藻，以降低藻毒素對養(yǎng)殖動物的毒害效應(yīng)。

2.3 硫氰酸紅霉素作用下養(yǎng)殖水體中關(guān)鍵水化學(xué)指標(biāo)的動態(tài)變化規(guī)律

3 討論

3.1 硫氰酸紅霉素對藍(lán)藻的抑殺作用

硫氰酸紅霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是紅霉素的硫氰酸鹽，既降低了紅霉素的毒副作用，又保留了紅霉素對原核生物的殺滅活性，是中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部允許使用的水產(chǎn)藥劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已得到廣泛應(yīng)用[24]。已有試驗表明，硫氰酸紅霉素可有效抑制微囊藻可溶性蛋白的合成，從而達(dá)到殺藻效果，96 h EC50為48.2 μg/L[15]。本試驗中各濃度硫氰酸紅霉素對藍(lán)藻及微囊藻都有很好的殺滅效果，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴效應(yīng)，試驗結(jié)束時對藍(lán)藻及微囊藻殺滅率均達(dá)99%以上?？梢娏蚯杷峒t霉素在應(yīng)急防控養(yǎng)殖水域藍(lán)藻水華方面具有明顯的優(yōu)勢。

3.2 硫氰酸紅霉素對底泥中微囊藻毒素含量的影響

底泥是MCs在養(yǎng)殖水體中儲積的主要場所，生物降解是MCs環(huán)境歸趨的主要途徑，底泥中細(xì)菌對MCs生物降解起著至關(guān)重要的作用[8]。田大軍等[25]研究指出，正常藍(lán)藻暴發(fā)時，底泥中MC-RR含量最高可達(dá)到0.802 μg/g，樊潔等[23]研究表明，自然水體下底泥中MC-LR含量最大值為0.28 μg/g，MC-RR最大含量為0.32 μg/g。本試驗表明，暴發(fā)藍(lán)藻水壺的生態(tài)圍隔中加入硫氰酸紅霉素后底泥中MC-RR含量最高達(dá)2.58 μg/g，MC-LR最高為3.39 μg/g，其藻毒素含量明顯高于自然水體中底泥的含量，究其原因可能是在硫氰酸紅霉素作用下藍(lán)藻細(xì)胞破裂死亡，短時間內(nèi)釋放出大量MCs儲積在生態(tài)圍隔底泥中，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過底泥環(huán)境中MCs降解微生物的降解負(fù)荷。當(dāng)硫氰酸紅霉素濃度為0.25 mg/L時，短時間內(nèi)儲積在底泥中MCs總量較小，且殺藻效果完全滿足實際生產(chǎn)需要，可以考慮在實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用該濃度硫氰酸紅霉素應(yīng)急防控藍(lán)藻水華，但仍需提前使用VC等高效解毒劑，以降低殺藻給養(yǎng)殖動物帶來的次生傷害。

3.3 硫氰酸紅霉素應(yīng)急殺藻對水化學(xué)指標(biāo)的影響

4 結(jié)論