3種寵物龜“灰白甲”病組織病理學研究

鮑曉穎，龐溦，潘連德、2*，張曉雨

(1.上海海洋大學 省部共建水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學 國家水生動物病原庫，上海 201306)

龜類作為觀賞寵物歷史悠久，飼養(yǎng)的寵物龜患有“灰白甲”病癥較為常見，雖然病龜活動及攝食基本正常，但因病因和病理不清，目前尚無根治辦法，病龜背甲或腹甲的灰白色病變嚴重時就會危及生命，且降低了寵物龜?shù)挠^賞價值，一些名貴品種還會因此造成嚴重的經濟損失。

龜類甲殼出現(xiàn)病變的情況常發(fā)生在巴西龜Trachemysscriptaelegans[1-2]、火焰龜Pseudemysconcinna[1]、甜甜圈龜Pseudemysconcinna[2]、地圖龜Graptemysspp.[3]、沙漠陸龜Gopherusagassizii[4]等龜種，病龜?shù)呐R床癥狀為甲殼病變處出現(xiàn)淺褐色凹陷或凸起、骨骼變軟、灰白色及橙色等顏色破損、形狀和質地的改變，所表現(xiàn)出的共同病理特征為病灶處廣泛的骨重建[1-2，4]、嗜酸性粒細胞[2-3]和異嗜白細胞[4]等炎性細胞浸潤的全身性炎癥表現(xiàn)。目前，引起巴西龜[1]、火焰龜Pseudemysconcinna[1]、沙漠陸龜Gopherusagassizii[4]、黃喉擬水龜Mauremysmutica[5-6]、平背麝香龜Sternotherusdepressus[7]、亞達伯拉龜Geochelonegigantea[8-9]、加拉帕戈斯龜Chelonoidisnigramicrophyes[10]、德州地鼠龜Gopherusberlandieri[11]等甲殼疾病的細菌[4-6，8-9，12]、真菌[9-11]、寄生蟲[1]、水體毒素[7]等病原學和病因的研究，為龜類甲殼病相關研究奠定了基礎。但對龜類患“灰白甲”病的研究極少，僅見甲殼角化不良癥的沙漠陸龜[4]和甲殼鐮刀菌感染癥的德州地鼠龜[11]等兩種陸生龜類的研究報道，尚未見水生龜類的相關報道。本研究中，對患“灰白甲”病的3種水生寵物龜6個病例進行了器官病理和組織病理學觀察比較，旨在為該類疾病的病因分析和發(fā)病機理提供科學依據(jù)，并為臨床診斷和控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年9月，收集家庭飼養(yǎng)的具有灰白甲癥狀的各種寵物龜若干只于上海海洋大學大學水族寵物醫(yī)學實驗室，從中選擇癥狀典型的2只巴西龜(1號，背甲長為7.7 cm，體質量為0.09 kg，雌性；2號，背甲長為9.7 cm，體質量為0.15 kg，雄性)，2只中華草龜(3號，背甲長為6 cm，體質量為0.048 kg，雄性；4號，背甲長為15 cm，體質量為0.626 kg，雌性)，2只黃頭側頸龜(5號，背甲長為14 cm，體質量為0.402 kg，雌性；6號，背甲長為13.2 cm，體質量為0.346 kg，雌性)。集中飼養(yǎng)在長×寬為120 cm×40 cm、深度為8～10 cm的帶有過濾裝置的室內龜缸中，穩(wěn)定水溫為27～29 ℃，用龜糧(Hikari)和鮮蝦肉飼喂。正式試驗時禁食。試驗龜編號(1～6號)通過留下與托盤上數(shù)字代碼的合照影像識別，并進行臨床體檢以確定性別和健康狀況，排除患有其他疾病的試驗龜。將其中3只龜(1號、4號、5號)作為組織病理試驗用龜，將另外3只龜(2號、3號、6號)作為活體龜背甲采樣試驗用龜。

1.2 方法

1.2.1 3種病龜?shù)呐R床癥狀與病理解剖觀察 試驗開始時評估每只病龜背甲和腹甲病變的范圍，通過肉眼觀察和暗室伍德燈(七外光品牌，008號，5顆燈珠)下觀察，加以驗證，取巴西龜1號、中華草龜4號和黃頭側頸龜5號進行臨床癥狀觀察和病理解剖，記錄龜體表和臟器的病理變化，以確定病變部位或器官。試驗龜干露濕身和干身狀態(tài)時，分別采集圖片，做出3種病龜臨床癥狀和病理解剖特征描述和診斷。

1.2.2 3種病龜組織病理制片和觀察 將巴西龜1號、中華草龜4號、黃頭側頸龜5號肌肉注射舒泰25 mg/kg 進行麻醉[13]，用沖擊電鉆(歐萊德)進行直徑1 cm的龜甲全厚度取樣，在EDTA脫鈣液中脫鈣20 d。取龜甲樣品后解剖，取病龜?shù)男?、肝、脾、肺、腎、腸道和胰腺等重要臟器，切成約5 mm組織塊，置于10%中性甲醛中固定24 h后，沖水5 h。用體積分數(shù)為50%～100%的乙醇溶液對試驗龜甲和組織塊逐級脫水，透明。于56～58 ℃下用石蠟包埋，切片厚度為5～7 μm，并于60 ℃下烘片1 h，用Masson三色法和Perls blue法對試驗龜甲染色，用H.E法對試驗龜甲及其重要臟器組織染色，中性樹膠封片，于徠卡DM3000顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3 活體龜背甲可恢復采樣方法 將巴西龜2號、中華草龜3號、黃頭側頸龜6號肌肉注射舒泰25 mg/kg 進行麻醉[13]，在病龜背甲病灶確定采樣位置，用酒精消毒，使用沖擊電鉆(歐萊德)環(huán)形直徑1 cm的鉆頭，進行龜甲全厚度取樣(圖1-A)。取得樣品后的創(chuàng)傷空洞, 用牙科樹脂(靚雅)密封[3，9，14]，用0.9%無菌生理鹽水沖洗,將EDTA溶液涂抹創(chuàng)面，涂上酸蝕劑(杭州西湖巴爾)15 s后用生理鹽水清洗，再將黏結劑(杭州西湖巴爾)涂抹于整個洞壁(圖1-B),直接涂抹第二層黏結劑，15 s后輕吹約2 s,用標準光固化燈(靚雅)光照20 s使牙科樹脂固化,進行空洞填充(圖1-C)。采樣完畢的試驗龜干養(yǎng)24 h后，將其移至室內龜缸中，后腿基部肌肉注射硫酸慶大霉素注射液(山西省芮城科龍獸藥)，劑量為40 mg/kg體質量，每隔24 h 注射一次，共注射7次。

2 結果與分析

2.1 3種病龜?shù)呐R床癥狀與病理解剖特征

2.1.1 3種病龜?shù)呐R床癥狀及其比較 3種病龜患病后活動、攝食情況未見異常，除背腹面甲殼表面產生部分或全部 “灰白甲”病變的臨床癥狀外，體表、四肢和頭頸均未見其他異常(圖2)。3種病龜早期癥狀為背甲上出現(xiàn)零星灰白色點狀病灶，隨著病情的發(fā)展，背甲零星白點病灶連成大的白斑病灶(圖2-B)，繼續(xù)發(fā)展背甲小部分或一半(圖2-C)變成灰白色病灶，最終達到整個背甲或腹甲形成灰白色病灶(圖2-A)。背甲灰白色病灶質地粗糙，角質片易剝落(圖2-A)。在黑暗環(huán)境中，用伍德燈照射3種病龜背部和腹部，灰白色病灶產生明顯的熒光現(xiàn)象(圖3)，未病變部分未出現(xiàn)熒光現(xiàn)象(圖3-C)，巴西龜(圖3-A)和黃頭側頸龜(圖3-C)的甲片接縫間(生長紋)都未產生病變，而中華草龜病變明顯(圖3-B)。伍德燈檢驗與肉眼觀察一致且更加清晰準確，適合臨床檢查診斷。3種病龜?shù)谋臣捉员雀辜撞∽冊缜腋鼮槊黠@。

2.1.2 3種病龜?shù)牟±斫馄侍卣骷捌浔容^ 臨床解剖觀察可見，1號和4號病龜脂肪塊呈黑色(圖4-A、B)，4號和5號病龜肝呈黑褐色顏色異常、體積腫大(圖4-B、C、E、F)，1號病龜肝呈黃褐色顏色異常(圖4-A、D),4號病龜肝臟上有白色結節(jié)、脾腫大(圖4-E)，其他器官未見明顯異常。

2.2 3種病龜背甲病變及其比較

2.2.1 3種病龜背甲全厚度橫切面的基本結構 龜背甲由角質層、密質層和松質層構成(圖5-A、D)，Masson三色染色的2號巴西(圖5-A)、3號中華草龜(圖5-B)和6號黃頭側頸龜(圖5-C)背甲分層比H.E染色(圖5-D、E、F)更清晰?？梢?，水生龜類的背甲結構獨特，由外向內分別為角質層、表皮層、真皮層、骨髓腔、骨小梁、骨內膜、骨外膜等層狀結構(圖5-B、E、C、F)。

2.2.2 3種病龜背甲全厚度橫切面病理變化 病龜背甲全厚度橫切面角質層的膠原纖維結構稀疏、變形、壞死碎裂和脫落，在2號巴西龜(圖6-A)、3號中華草龜(圖6-B)、6號黃頭側頸龜(圖6-C)中均有表現(xiàn), 其中，2號巴西龜(圖6-D)、3號中華草龜(圖6-E)和6號黃頭側頸龜(圖6-F)背甲各層中均分布大量黑色素，為“灰白甲”癥狀提供了組織病理佐證。背甲松質骨層骨髓腔浸潤大量的嗜酸性粒細胞及大量黑色素沉積(圖6-G、H、I)，松質骨層骨髓腔浸潤的嗜酸性粒細胞明顯(圖6-J、K、L)，為灰白甲癥狀提供了組織炎癥的病理佐證。

2.2.3 3種病龜背甲全厚度縱切面H.E染色病理結果 3種病龜背甲松質骨層骨髓腔浸潤存在大量的嗜酸性粒細胞及黑色素沉積(圖7-A、B、C)。背甲表皮層、真皮層和密質骨層中存在黑色素，6號黃頭側頸龜分布最多(圖7-I)，其次是2號巴西龜(圖7-D、G)和3號中華草龜(圖7-H、K)。

2.2.4 3種病龜背甲全厚度縱切面Perls blue染色結果 2號巴西龜松質骨層骨髓腔中存在大量黑色素細胞(圖7-J), 3號中華草龜真皮層中存在大量黑色素細胞(圖7-K),6號黃頭側頸龜松質骨層骨髓腔中也存在大量黑色素細胞(圖7-L),但均未見含鐵血黃素。

2.3 3種病龜主要組織器官的病變及其比較

3種病龜?shù)钠⒔M織都出現(xiàn)了嗜酸性粒細胞浸潤的明顯炎癥(圖8-A、B、C)。1號巴西龜?shù)囊认俪霈F(xiàn)管壁增厚病變(圖8-D)，其他無異常(圖8-E、F)。1號巴西龜?shù)哪I組織出現(xiàn)顆粒變性(圖8-G)，4號中華草龜?shù)哪I小管空泡化(圖8-H)，5號黃頭側頸龜腎小管擴張病變，局部有嗜酸性粒細胞浸潤(圖8-I)。3種病龜?shù)母谓M織都出現(xiàn)了大量黑色素(圖8-J、L)，4號中華草龜?shù)母谓M織出現(xiàn)肉芽腫和嗜酸性粒細胞浸潤(圖8-K)。3種病龜?shù)男?、肺、腸組織組織結構一致，均未見異常。

2.4 活體龜背甲可恢復采樣結果

2號巴西龜、3號中華草龜、6號黃頭側頸龜用沖擊鉆取樣后的創(chuàng)口處置和結果相同，如2號巴西龜?shù)膭?chuàng)口(圖9-A)，經牙科樹脂封閉(圖9-B)和后腿基部肌肉注射硫酸慶大霉素治療后，歷經兩個月恢復期，試驗龜背甲創(chuàng)口長出新生組織且完全愈合(圖9-C)，封閉物脫落。3只病龜創(chuàng)口均康復，攝食和活動均正常。

3 討論

3.1 寵物龜 “灰白甲”病的組織病理學診斷

水生寵物龜“灰白甲”病的病例十分常見,在干露狀態(tài)下肉眼觀察到龜?shù)谋臣谆蚋辜子谢野咨邏K，或整個龜甲灰白色明顯而一致的臨床癥狀，再用伍德燈照射有熒光現(xiàn)象，可以做出初步診斷。依據(jù)“灰白甲”病的寵龜背甲病變處出現(xiàn)角蛋白纖維的壞死和碎裂，以及骨髓腔內和脾組織出現(xiàn)嗜酸性粒細胞浸潤等組織病理特征,就可以做出準確診斷。

由此可見，病龜龜甲呈灰白色為角蛋白纖維的壞死和碎裂造成的表面粗糙。觀察比較干露濕身和干身狀態(tài)下灰白甲癥狀，干露干身狀態(tài)比濕身狀態(tài)灰白色更為明顯，亦可佐證這一點，故臨床癥狀結果全部采用干露干身圖片。

患 “灰白甲”病的3種水生寵物龜?shù)呐R床癥狀和甲殼病理變化與美國加利福尼亞州的莫哈韋沙漠、科羅拉多沙漠中的沙漠陸龜?shù)募讱そ腔涣及Y[4]，以及美國德克薩斯州南部的德州地鼠龜?shù)募讱ょ牭毒腥景Y[10]相似，因上述文獻缺乏器官組織病理研究結果，而無法比較。“灰白甲”病與巴西龜[1-2]、火焰龜[1]、甜甜圈龜[2]、地圖龜[3]的殼病，黃喉擬水龜?shù)母瘹げ5]與體表潰瘍[6]，平背麝香龜[7]及亞達伯拉龜中擬青霉引起的肥厚菌病[8]，真空輔助閉合治療烏龜深部膿腫和骨髓炎[9]，以及加拉帕戈斯龜甲殼病[10]的臨床癥狀和組織病理特征不同。內臟組織嗜酸性粒細胞浸潤的組織病理特征在養(yǎng)殖菱斑龜代謝性肝病[15]和中華草龜恩諾沙星中毒癥[16]中均有提到。脾是龜重要的免疫器官，脾中不正常的高嗜酸性粒細胞數(shù)量與寄生蟲感染(如原生動物、蠕蟲)或其他的抗原刺激有關[17]。

本研究中還采集了患“灰白甲”病的巴西龜、中華草龜、黃頭側頸龜?shù)牟≡罱M織和附著物，制作水浸片、棉蘭染色、碘酊染色，光學顯微鏡檢查均未發(fā)現(xiàn)致病性藻類、寄生蟲、真菌等病原；病灶分離了若干優(yōu)勢菌株，以繼續(xù)進行病原學研究。養(yǎng)殖環(huán)境(水硬度、pH和水質指標的變化)及其微生物也可能是發(fā)病原因。該病的病原(病因)有待進一步研究。

3.2 伍德燈和牙科樹脂在龜殼病診斷和治療上的應用

伍德燈是人類和寵物皮膚科臨床檢查的一種輔助診斷工具[18]，本研究中用于寵物龜“灰白甲”病的臨床檢驗能夠實現(xiàn)無創(chuàng)、簡便、快速、準確的臨床效果，并彌補肉眼難以確定的寵物龜“灰白甲”病癥狀及其他一些皮膚病。

3種龜龜甲皆由骨質板及覆蓋于骨質板外的角質盾所構成[19]，龜殼骨質板與動物骨骼結構相似，分為密質層和松質層兩部分[20-21]。寵物龜使用沖擊電鉆進行的龜甲全厚度取樣，取得樣品后的創(chuàng)傷空洞, 用牙科樹脂(甲基丙烯酸甲酯)密封，這種活體龜背甲可恢復采樣方法非常適用，可用于甲殼疾病和創(chuàng)傷的臨床治療[3，9，14]。

3.3 寵物龜“灰白甲”病的病理機制及其危害

本試驗中的巴西龜、中華草龜、黃頭側頸龜?shù)?種水生寵物龜6只患“灰白甲”病的病龜，具有共同臨床癥狀和組織病理特征，3種龜脾、腎組織和背甲骨髓腔均浸潤大量嗜酸性粒細胞炎癥及呈現(xiàn)大量黑色素沉積的特征，說明3種龜患“灰白甲”病的病因和病理機制相同?！盎野准住辈〉陌l(fā)展慢、病程長，逐漸蔓延到整個背甲和腹甲后，降低或失去了寵物龜?shù)挠^賞價值，從病龜重要組織的大量嗜酸性粒細胞浸潤和黑色素沉積的病理結果也揭示了對龜?shù)慕】滴：Α?/p>