凋亡調(diào)節(jié)蛋白XIAP與Omi/HtrA2在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系

卞 樂，艾麗梅

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液二科, 遼寧 錦州 121000)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)的一類，呈高發(fā)病和高度侵襲性，約占成人NHL的30%，且我國DLBCL的發(fā)病人數(shù)也在逐年增多[1]，經(jīng)積極的治療少部分患者可有較好預(yù)后[2-3]。凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)是一類抑制細(xì)胞凋亡的家族，國內(nèi)外研究表明生物體細(xì)胞的凋亡失去控制是導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生的機(jī)制之一[4]。IAPs家族中作用較強(qiáng)的成員X染色體連鎖凋亡抑制因子(X-linked inhibitor of ap-optosis protein，XIAP)，主要通過抑制半胱酸天冬氨酸蛋白酶分子(caspase)的活性來抑制細(xì)胞凋亡[5]。線粒體產(chǎn)生的一種特殊的絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2，可阻止XIAP和caspase的這種結(jié)合而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[6-8]，XIAP和Omi/HtrA2在細(xì)胞中的特異性表達(dá)與機(jī)體惡性病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)，但國內(nèi)外對(duì)這兩種蛋白在DLBCL中的表達(dá)研究甚少。本研究采用免疫組織化學(xué)的方法檢測XIAP與Omi/HtrA2在DLBCL中的表達(dá)情況，并分析二者的相關(guān)性，通過隨訪分析兩種蛋白與DLBCL患者的預(yù)后，為DLBCL的靶向治療和預(yù)后評(píng)估提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2017年1月至2018年12月間于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診或住院治療的59例DLBCL患者病理切片為實(shí)驗(yàn)組。參照2013版《中國彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤診斷和治療指南》及2011版《彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤臨床路徑》，以活檢病理學(xué)和免疫組織化學(xué)分析明確診斷，其中發(fā)病年齡25～79歲，中位年齡為62歲，男性32例，女性27例，病理類型：生發(fā)中心(GCB)型28例，非生發(fā)中心(nGCB)型31例，Ann Arbor-Cotswolds分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期9例，Ⅲ期19例，Ⅳ期15例。同時(shí)選取同期在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診或住院治療的30例淋巴結(jié)反應(yīng)增生(RCL)患者病理切片作為對(duì)照組。

1.2 相關(guān)試劑 XIAP兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶200)、Omi/HtrA2兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶100)購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 研究方法 采用免疫組織化學(xué)法將石蠟切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟和水化后，將切片于蒸餾水中浸泡1 min，用PBS沖洗5 min，共沖洗3次，在高壓鍋中用檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫后用50 μl的過氧化物酶阻斷，室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min，滴加封閉用正常山羊血清50 μl，室溫孵育20 min，甩去多余的液體，擦干切片，勿洗，滴加一抗，4 ℃濕盒過夜，次日取出切片，PBS緩沖液沖洗5 min，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物50 μl，室溫孵育15 min，PBS沖洗5 min，用50 μl辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育20 min，在光學(xué)顯微鏡下用新鮮配制的DAB溶液顯色5 s，蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化后復(fù)染，最后經(jīng)逆濃度乙醇脫水，二甲苯透明化后用中性樹脂固封。

1.4 結(jié)果判定 在光學(xué)顯微鏡下應(yīng)用半定量積分的方法，即根據(jù)每張病理切片染色的深淺程度和蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞比例來計(jì)算積分。切片染色程度：無著色即0分，淺黃色即1分，棕黃色記2分，深棕色記3分。蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞比例：無陽性表達(dá)記0分，陽性表達(dá)小于25%記1分，陽性表達(dá)在25%～50%記2分，陽性表達(dá)大于50%記3分。最后的得分是將每張病理切片染色程度得分和蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞比例得分兩兩相乘。結(jié)果判定如下：陰性(-)： 0～1 分；弱陽性(+)：2～3 分；中等陽性(++)：4～6 分；強(qiáng)陽性(+++)：6分以上。觀察結(jié)果由至少2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師判定，若得出的結(jié)果沖突，可進(jìn)行3次觀察與計(jì)算，得出最終結(jié)論。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)；應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析XIAP和Omi/HtrA2蛋白表達(dá)的相關(guān)性；應(yīng)用Kaplan-meier法分析XIAP和Omi/HtrA2的表達(dá)與DLBCL患者的預(yù)后；應(yīng)用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型計(jì)算各臨床因素的風(fēng)險(xiǎn)比(hazard radio，HR)和95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)來評(píng)估對(duì)疾病預(yù)后不良的影響程度，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 XIAP在DLBCL和RHL組織中的表達(dá) XIAP在DLBCL組織中主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá) ，為棕黃色顆粒狀，形態(tài)、大小不等(圖1)，陽性率為61.02%(36/59)，在RHL組織中的陽性表達(dá)為36.67%(11/30)(圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030)，見表1。

表1 DLBCL和RHL組織中XIAP表達(dá)

注：χ2=4.732，P=0.030

2.2 Omi/HtrA2在DLBCL和RHL組織中的表達(dá) Omi/HtrA2在DLBCL組織中主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，為形態(tài)大小不均的棕黃色顆粒狀(圖3)，陽性率為52.54%(31/59)，在RHL組織中可見少量棕黃色顆粒(圖4)，陽性率為30.00%(9/30)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.043)，見表2。

圖1 XIAP在DLBCL組中的表達(dá)(SP×400) 圖2 XIAP在RHL組中的表達(dá)(SP×400)

圖3 Omi/HtrA2在DLBCL組中的表達(dá)(SP×400) 圖4 Omi/HtrA2在RHL組中的表達(dá)(SP×400)

表2 DLBCL和RHL組織中Omi/HtrA2表達(dá)

注：χ2=4.084，P=0.043

2.3 XIAP和Omi/HtrA2表達(dá)的相關(guān)性分析 采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，二者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P=0.018)，見表3。

表3 XIAP與Omi/HtrA2表達(dá)的相關(guān)性(例)

2.4 XIAP蛋白與DLBCL臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 XIAP的陽性表達(dá)與DLBCL患者的臨床分期(P=0.012)、病理類型(P=0.012)、乳酸脫氨酶(LDH)水平(P=0.026)、淋巴瘤國際預(yù)后指數(shù)(IPI)評(píng)分(P=0.043)相關(guān)，與患者的性別、年齡、有無結(jié)外受累、癥狀分組無關(guān)(P>0.05)，見表4。

2.5 Omi/HtrA2蛋白與DLBCL臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 Omi/HtrA2的陽性表達(dá)與DLBCL患者的臨床分期(P=0.033)、病理類型(P=0.013)、LDH水平(P=0.010)、IPI評(píng)分(P=0.019)相關(guān)，與性別、年齡、癥狀分組、有無結(jié)外受累無關(guān)(P>0.05)，見表5。

2.6 生存分析 本研究對(duì)59例DLBCL患者進(jìn)行了電話隨訪，截止到2019年12月31日，隨訪時(shí)間為40個(gè)月，期間有2例患者失訪，失訪率為3.38%，其中死亡27例，復(fù)發(fā)31例，1年總生存率(OS)84.75%，2年OS 64.41%，3年OS 55.56%；1年無進(jìn)展生存率(PFS)83.05%，2年P(guān)FS 59.32%，3年P(guān)FS 47.00%。

2.6.1 XIAP蛋白的表達(dá)與DLBCL預(yù)后的關(guān)系 生存分析顯示，XIAP陽性表達(dá)的患者3年OS和3年P(guān)FS與陰性表達(dá)的患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007，P=0.008)，見圖5～6。

2.6.2 Omi/HtrA2蛋白的表達(dá)與DLBCL預(yù)后的關(guān)系 生存曲線顯示，Omi/HtrA2陽性表達(dá)的患者3年OS和3年P(guān)FS與陰性表達(dá)的患者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.122，P=0.385)，見圖7～8。

2.6.3 XIAP和Omi/HtrA2共同表達(dá)與DLBCL的預(yù)后 由生存曲線可看出，XIAP和Omi/HtrA2雙陽性表達(dá)與雙陰性表達(dá)的患者3年OS和3年P(guān)FS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.466，P=0.261)，但從曲線中可以看出XIAP單陽性表達(dá)的患者無論Omi/HtrA2是否為陽性，患者的3年OS和3年P(guān)FS差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖9～10。

表5 Omi/HtrA2與DLBCL臨床病理學(xué)特征的關(guān)系[例(%)]

圖5 XIAP蛋白的OS曲線 圖6 XIAP蛋白的PFS曲線

圖7 Omi/HtrA2蛋白的OS曲線 圖8 Omi/HtrA2蛋白的PFS曲線

圖9 XIAP和Omi/HtrA2共同表達(dá)的OS曲線 圖10 XIAP和Omi/HtrA2共同表達(dá)的PFS曲線

2.6.4 臨床指標(biāo)單因素及多因素預(yù)后分析 采用Kaplan-meier法對(duì)各個(gè)臨床指標(biāo)進(jìn)行分析，包括患者性別、年齡、淋巴瘤分期、LDH水平、癥狀分組、 病理類型和有無結(jié)外受累等。結(jié)果顯示：患者的性別、年齡、癥狀分組、結(jié)外受累與患者預(yù)后無關(guān)(P>0.05)?；颊吡馨土龇制跒棰蟆?P=0.022)、LDH>250 U/L(P=0.015)、病理類型為nGCB(P=0.034)、IPI為中高危(P=0.001)是DLBCL患者3年OS的預(yù)后不良因素，患者淋巴瘤分期為Ⅲ～Ⅳ(P=0.017)、LDH>250 U/L(P=0.041)、病理類型為nGCB(P=0.026)、IPI為中高危(P=0.018)是DLBCL患者3年P(guān)FS的預(yù)后不良因素。

采用COX回歸多風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析得出XIAP的陽性表達(dá)是影響DLBCL患者3年OS(HR=7.527，95%CI為1.527～37.049，P=0.013)和3年P(guān)FS(HR=0.291，95%CI為0.125～0.677，P=0.004)的獨(dú)立預(yù)后不良因素，見表6～7。

表6 單因素分析DLBCL的3年OS和3年P(guān)FS

表7 DLBCL的3年OS和3年P(guān)FS多因素分析

3 討 論

細(xì)胞凋亡，又稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)，是多生物體細(xì)胞經(jīng)特定基因的調(diào)控自動(dòng)發(fā)生死亡的過程，可有效維持人體自身平穩(wěn)，細(xì)胞凋亡失去控制是機(jī)體產(chǎn)生腫瘤的機(jī)制之一[9-10]。

XIAP定位于染色體Xq25位點(diǎn)，具有兩個(gè)特征性的分子結(jié)構(gòu)域，一是位于XIAP氨基端的3個(gè)桿狀凋亡蛋白抑制重復(fù)序列(BIR)，IAPs家族主要依賴BIR結(jié)構(gòu)域發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，二是位于XIAP羧基端的1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)環(huán)(RING)，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)有泛素蛋白連接酶的作用。XIAP抗細(xì)胞凋亡的作用主要與抑制caspase[5, 11]、激活核因子κB(NF-κB)途徑和參與多條信號(hào)通路有關(guān)[12]。國內(nèi)外大量研究顯示XIAP在胃癌[13]、乳腺癌[14]、卵巢癌[15]、肺癌[16]等惡性病的組織均呈現(xiàn)特異性表達(dá)。

Omi/HtrA2是一種主要分布在線粒體的促凋亡蛋白，在凋亡信號(hào)的作用下Omi/HtrA2可轉(zhuǎn)化為具有促細(xì)胞凋亡的成熟因子，由線粒體釋放至胞內(nèi)，通過依賴caspase和非依賴caspase兩條通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。在依賴caspase途徑中，成熟的Omi/HtrA2氨基端可直接與IAPs氨基端的BIR特異性結(jié)合，降解IAPs，恢復(fù)caspase的活性從而解除對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制，也可通過利用自身蛋白酶的活化促進(jìn)凋亡。有研究顯示，Omi/HtrA2在白血病、乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤疾病中以多種的途徑促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[18-20]。

本實(shí)驗(yàn)顯示，XIAP和Omi/HtrA2在DLBCL中呈高表達(dá)，在RHL中為低表達(dá)甚至不表達(dá)，二者的陽性表達(dá)與DLBCL的臨床分期、病理類型、LDH水平、IPI評(píng)分有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、癥狀分組、結(jié)外受累無關(guān)(P>0.05)。XIAP和Omi/HtrA2表達(dá)為負(fù)相關(guān)，說明XIAP和Omi/HtrA2在DLBCL中作用相互抑制。

此外Kaplan-meier曲線顯示XIAP與DLBCL患者預(yù)后相關(guān)，而Omi/HtrA2與患者預(yù)后無關(guān)，不能作為判斷預(yù)后的指標(biāo)，但通過生存曲線得出Omi/HtrA2陽性率高的患者比陽性率低的患者預(yù)后好，可能是高表達(dá)的Omi/HtrA2促進(jìn)了惡性細(xì)胞的凋亡，減少了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)從而使患者的生存期延長。

綜上所述，XIAP和Omi/HtrA2在DLBCL中同為高表達(dá)，表達(dá)為負(fù)相關(guān)性，二者作用相互拮抗，檢測XIAP和Omi/HtrA2有助于DLBCL的臨床診斷和靶向治療，XIAP與DLBCL的預(yù)后相關(guān)，有望成為評(píng)估預(yù)后的新指標(biāo)。