HPLC法同時檢測食醋中川芎嗪和阿魏酸的含量

李建龍,劉書亮,*,彭 楊,劉 軍,楊 勇,韓新鋒,侯曉艷,夏小龍,羅佩文,賈秋思

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014;2.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢 643000;3.四川保寧醋有限公司,四川閬中 645000)

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HPLC法同時檢測食醋中川芎嗪和阿魏酸的含量

李建龍1,劉書亮1,*,彭 楊1,劉 軍2,楊 勇3,韓新鋒1,侯曉艷1,夏小龍1,羅佩文1,賈秋思1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014;2.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢 643000;3.四川保寧醋有限公司,四川閬中 645000)

本文建立了一種高效液相色譜法同時檢測食醋中川芎嗪和阿魏酸的方法,其檢測條件為:采用Sepax GP-C18柱,流動相:甲醇∶水(含0.2%冰乙酸)=23∶77(v/v),檢測波長310nm,柱溫35℃,進(jìn)樣量10μL,1.0mL/min等梯度洗脫。結(jié)果表明:川芎嗪在1.00～60.00μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2=0.990,保留時間為14.71min;而阿魏酸在1.00～15.00μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為R2=0.997,保留時間為19.45min;該方法檢測川芎嗪和阿魏酸的檢出限分別為0.115、0.041μg/mL,測定限分別為0.383、0.135μg/mL;加標(biāo)回收實驗的結(jié)果得出川芎嗪的平均回收率為100.01%,阿魏酸的平均回收率為99.85%。該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確,樣品前處理簡便,可應(yīng)用于食醋產(chǎn)品中川芎嗪和阿魏酸檢測。

高效液相色譜法,阿魏酸,川芎嗪,食醋

食醋是日常生活中重要的調(diào)味品,其在我國的飲食文化中地位頗高,隨著對食醋的深入研究,現(xiàn)已確定了食醋中含有相當(dāng)豐富的營養(yǎng)物質(zhì),如蛋白質(zhì)、氨基酸和碳水化合物(葡萄糖、麥芽糖等),其有機(jī)酸含量也較為豐富(除乙酸外,還有乳酸、檸檬酸、丙酮酸及琥珀酸等),同時食醋還含有維生素和礦物質(zhì)[1-5]。近年來,科研人員對食醋中功能成分的研究日益加強(qiáng),其中對川芎嗪(四甲基吡嗪,C8H12N2,Tetramethylpyrazine,TMP)和阿魏酸(又名肉桂酸,4-羥基-5-甲氧基苯丙酸,C10H10O4,Ferulic acid)等物質(zhì)的研究較為深入[6-8]。川芎嗪和阿魏酸是已知的食醋中重要的風(fēng)味物質(zhì)[1,8-9],川芎嗪還作為食品添加劑,應(yīng)用于相關(guān)加工食品中。阿魏酸和川芎嗪都具有抗血小板聚集,緩解血管痙攣,增加冠脈流量,改善微循環(huán)及增加腦血流量等作用[10-11]。

研究表明川芎嗪、阿魏酸已經(jīng)成為食醋成分中的功能指標(biāo)[12-13]。關(guān)于食醋中川芎嗪和阿魏酸的檢測方法主要有薄層洗脫比色法[14]、薄層顯色掃描法[15]及高效液相色譜法(HPLC)[16-18]等,且國內(nèi)文獻(xiàn)報道多為測定一種成分含量方法,費(fèi)時費(fèi)力,因此,建立一種同時檢測食醋中川芎嗪、阿魏酸的方法非常必要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

特級保寧醋 市售;川芎嗪、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海金穗生物科技有限公司(98%);甲醇(色譜純) 廣東光華科技股份有限公司。

其它試劑均為分析純。LC-10A2010C HT型液相色譜儀、LC-solution工作站 日本島津公司;AS10200A超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯公司;Milli-Q超純水儀 美國密理博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 待測樣品的提取 精確量取食醋5mL置于100mL具塞三角瓶中,用NaOH溶液調(diào)pH至8.5,按1∶4的比例加入40%乙醇提取溶劑。超聲提取45min(40kHz,100W,40℃)[19],混勻后取5mL離心(12000r/min,10min),將上清液用有機(jī)相濾膜(0.45μm)過濾,棄去初濾液2mL,取續(xù)濾液0.5mL供高效液相色譜儀分析用[20]。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Sepax GP-C18柱(150mm×4.60mm,5.0μm);流動相:甲醇∶水(0.2%冰乙酸)=23∶77(v/v);流速:1mL/min;柱溫:35℃;紫外檢測器,波長:310nm;進(jìn)樣量:10μL。

1.2.3 樣品的同步提取 川芎嗪是脂溶性物質(zhì),易溶于熱水、石油醚,溶于氯仿、乙醇,稀鹽酸,微溶于乙醚,不溶于冷水;阿魏酸易溶于熱水,難溶于苯和石油醚[21]。由于兩者都溶于乙醇,且乙醇方便易得,無毒無害[22],故采用乙醇作為提取溶劑;川芎嗪和阿魏酸易溶于熱水,故提取過程在熱水中進(jìn)行,考察在20、40、60℃下樣品的回收率,并在處理樣品時探索在酸性和堿性環(huán)境下HPLC色譜圖中雜質(zhì)峰的數(shù)量,以此確定樣品的同步提取的條件。

1.2.4 檢測波長的確定 用甲醇(色譜純)分別將川芎嗪和阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解,制成質(zhì)量濃度約為10μg/mL的溶液,在200～400nm的波長范圍進(jìn)行紫外光全波長掃描。

1.2.5 流動相的選擇 阿魏酸為酸性化合物,易電離,在流動相中加入少量酸,可改善峰形,川芎嗪雖為堿性化合物,遇酸成鹽,造成拖尾現(xiàn)象,但在酸性環(huán)境中的分離效果較好[19-20]?？疾焖姆N流動相甲醇∶水、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.1%冰乙酸)、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.5%冰乙酸)對阿魏酸和川芎嗪分離的影響(分配比為60∶40,v/v)[16],選擇基線平穩(wěn)、分離度好的流動相做進(jìn)一步研究。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精確稱取川芎嗪、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品1mg,用1mL甲醇(色譜純)溶解,并分別配制成川芎嗪、阿魏酸濃度為60μg/mL和20μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。精密吸取儲備液,將川芎嗪儲備液稀釋成濃度為60、50、25、12.5、10、5.0、1.0μg/mL,阿魏酸儲備液稀釋成濃度為15、10、5、3.3、2.5、2.0、1.0μg/mL,得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品供試液。用有機(jī)相濾膜(0.45μm)過濾,-4℃保存待用。按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC測定,分別以川芎嗪和阿魏酸質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

1.2.7 檢出限和測定限 檢出限(detection limit)和測定限(determination limit)是對一種檢測方法評價的重要指標(biāo)。分別精確吸取儲備液,將川芎嗪儲備液稀釋成濃度為0.01、0.02、0.04、0.06.0.08、0.10、0.20μg/mL,阿魏酸儲備液稀釋成濃度為0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、1.00μg/mL,按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC測定。噪音值(S/N)=3時的濃度是檢測限,噪音值(S/N)=10時的濃度為測定限。

1.2.8 精密度和穩(wěn)定性實驗 分別精確吸取儲備液,將川芎嗪儲備液稀釋成濃度為30.0μg/mL,阿魏酸儲備液稀釋成濃度為3.0μg/mL,連續(xù)進(jìn)樣5次,按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC測定,用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示精密度。

穩(wěn)定性包括日內(nèi)穩(wěn)定性和日間穩(wěn)定性,在日內(nèi)(間隔4h)、日間(間隔1d)檢測混合標(biāo)準(zhǔn)液(川芎嗪30μg/mL;阿魏酸3μg/mL)中各物質(zhì)的質(zhì)量濃度,按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC測定,分析實際檢測到的質(zhì)量濃度,用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示穩(wěn)定性。

1.2.9 樣品的測定和回收率實驗 根據(jù)以上樣品的處理條件及檢測方法對食醋樣品進(jìn)行處理和檢測;回收率是以實際檢測樣品添加標(biāo)準(zhǔn)品后回收來進(jìn)行考察,精確量取食醋5mL置于100mL具塞三角瓶中,分別向三角瓶中加入適量川芎嗪和阿魏酸儲備液,川芎嗪的加標(biāo)水平為20、30、40、50、60μg/mL,阿魏酸的加標(biāo)水平為6.0、8.0、10.0、12.0、14.0μg/mL,每個水平設(shè)3個重復(fù),按上述樣品處理方法制備樣品,根據(jù)以上檢測方法測定川芎嗪和阿魏酸的質(zhì)量濃度。

回收率(%)=(Cn-Co)/W×100

式中：Cn-添加標(biāo)準(zhǔn)樣品后樣品中檢測的質(zhì)量濃度(μg/mL);Co-未添加標(biāo)準(zhǔn)品中樣品的檢測的質(zhì)量濃度(μg/mL);W-標(biāo)準(zhǔn)品的添加量(μg/mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 川芎嗪和阿魏酸的同步提取

通過比較20、40、60℃下超聲同步提取川芎嗪和阿魏酸,發(fā)現(xiàn)在40℃時兩種物質(zhì)回收率最高,且曾有報道稱[23-24],川芎嗪和阿魏酸在高溫下極易損失,應(yīng)盡量避免高溫,而提取溶劑乙醇在高溫下?lián)]發(fā)性極強(qiáng),綜上所述采用40℃提取為宜;阿魏酸存在順反式結(jié)構(gòu),反式結(jié)構(gòu)在一定時間內(nèi)會轉(zhuǎn)化為順式結(jié)構(gòu),且得到本實驗證實,所以樣品要在短時間內(nèi)進(jìn)行處理;將食醋樣品堿化可以使樣品中的其它酸類形成鹽類,且阿魏酸和川芎嗪在堿性條件下更穩(wěn)定,有利于提取,在該體系下通過超聲作用于樣品使阿魏酸和川芎嗪更易溶解在溶劑中,提高了目標(biāo)物質(zhì)的提取率,為之后的色譜分離提供條件。

2.2 檢測波長的確定

波長的掃描結(jié)果見圖1。由于流動相甲醇在200nm的紫外吸收信號較強(qiáng),會產(chǎn)生嚴(yán)重的基線干擾,且從光譜圖中看出,川芎嗪和阿魏酸的最大吸收波長分別為296nm和320nm,兼顧兩者,選擇310nm作為檢測波長。

圖1 川芎嗪和阿魏酸對照品吸收光譜Fig.1 UV spectrum of tetramethylpyrazine and ferulic acid standard

2.3 流動相的選擇

分析四種流動相甲醇∶水、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.1%冰乙酸)、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.5%冰乙酸)對阿魏酸和川芎嗪分離的影響,結(jié)果表明甲醇∶冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)和甲醇∶冰乙酸水溶液(0.5%冰乙酸),洗脫峰型良好且基線平穩(wěn),優(yōu)于其它流動相,但考慮到較高濃度的冰乙酸會對色譜系統(tǒng)造成一定的損害,故選擇甲醇∶冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)作為流動相。通過對比不同甲醇-冰乙酸水溶液分配比(20%、23%、26%,v/v)下的色譜圖(圖2～圖4),得出分配比為23%時色譜圖分離性較好,且出峰時間適宜,避開了樣品中雜質(zhì)峰的影響,因此選擇甲醇-冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)的分配比23%。

圖2 20%分配比下標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的HPLC色譜圖Fig.2 The chromatogram of standard sample and vinegar sample in 20% distribution ratio注:A-川芎嗪;B-阿魏酸;C-食醋樣品;D-食醋樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)品的樣品;E-川芎嗪和阿魏酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品，圖3、圖4同。

圖3 23%分配比下標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的HPLC色譜圖Fig.3 The chromatogram of standard sample and vinegar sample in 23% distribution ratio

圖4 26%分配比下標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的HPLC色譜圖Fig.4 The chromatogram of standard sample and vinegar sample in 26% distribution ratio

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由檢測結(jié)果得出,川芎嗪在1.00～60.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性回歸方程為Y=11623X-19495(R2=0.990),阿魏酸在1.00～15.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性回歸方程為Y=49162 X+2192(R2=0.997),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與峰面積之間的關(guān)系對樣品中川芎嗪和阿魏酸進(jìn)行定量。

2.5 檢出限和測定限

根據(jù)測定不同質(zhì)量濃度的川芎嗪和阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的檢測結(jié)果,得出川芎嗪和阿魏酸的檢出限分別為0.115、0.041μg/mL,測定限分別為0.383、0.135μg/mL。

2.6 精密度和穩(wěn)定性

精密度的實驗結(jié)果見表1,川芎嗪相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.31%,阿魏酸相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.15%,方法精密度高[25-26]。

表1 川芎嗪和阿魏酸精密度Table1 Precision of Tetramethylpyrazine and Ferulic acid

穩(wěn)定性實驗結(jié)果由表2、表3得出,該方法在檢測川芎嗪時日內(nèi)精密度RSD值為1.84%,日間精密度RSD的2.46%,阿魏酸的日內(nèi)穩(wěn)定性RSD的值為1.57%,日間穩(wěn)定性RSD值為2.87%,穩(wěn)定性符合要求。

表2 川芎嗪和阿魏酸日內(nèi)穩(wěn)定性Table2 Results of inter-day stability testfor Tetramethylpyrazine and Ferulic acid

表3 川芎嗪和阿魏酸日間穩(wěn)定性Table3 Results of Intra-day stability testfor Tetramethylpyrazine and Ferulic acid

2.7 樣品測定和回收率

按上述處理方法和色譜條件對樣品(特級保寧醋)中川芎嗪和阿魏酸含量進(jìn)行測定,結(jié)果得出,樣品中川芎嗪質(zhì)量濃度為51.52μg/mL,阿魏酸質(zhì)量濃度為11.54μg/mL,圖5為食醋樣品和對照品溶液的色譜圖,從圖5中可以看出川芎嗪的出峰時間為14.71min,阿魏酸的出峰時間為19.45min,由此可對阿魏酸和川芎嗪進(jìn)行定性。

圖5 食醋樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.5 The chromatogram of vinegar sample and standard sample 注:F-甲醇;G-川芎嗪和阿魏酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品;H-食醋樣品;I-川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)品;J-阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品。

樣品的回收率實驗結(jié)果如表4所示,其中川芎嗪的回收率為95.17%～106.08%,平均回收率達(dá)到100.01%,RSD為1.03%～3.01%,阿魏酸的回收率為96.25%～104.82%,平均回收率達(dá)到99.85%,RSD為0.93%～3.05%,回收率實驗結(jié)果在誤差范圍內(nèi),表明樣品的前處理方法符合要求[11,25]。

3 結(jié)論

3.1 本文采用乙醇溶劑體系輔助超聲提取食醋樣品中的川芎嗪和阿魏酸,并堿化處理食醋樣品使雜質(zhì)形成鹽類,有效去除了雜質(zhì);因阿魏酸為酸性化合物,易電離,在流動相中加入少量酸改善其峰形,且川芎嗪在酸性環(huán)境中的分離效果較好,故選擇甲醇和冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)為流動相,且甲醇∶水(0.2%冰乙酸)=23∶77(v/v)時目標(biāo)峰的峰型分離較好。

表4 不同加標(biāo)水平下的回收率實驗結(jié)果Table4 Results of recovery test for spiked samples

3.2 本文建立高效液相色譜法同時檢測食醋中川芎嗪和阿魏酸的方法,其檢測條件為:采用Sepax GP-C18柱,流動相:甲醇∶水(0.2%冰乙酸)=23∶77(v/v),檢測波長310nm,柱溫35℃,進(jìn)樣量10μL,1.0mL/min等梯度洗脫。由檢測方法的評價結(jié)果得出川芎嗪在1.0～60.0μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=11623X+19495(R2=0.990);阿魏酸在1.0～15.0μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=49162X+2192(R2=0.997),且川芎嗪和阿魏酸的檢出限分別為0.115、0.041μg/mL,測定限分別為0.383、0.135μg/mL,日內(nèi)、日間穩(wěn)定性較好,表明檢測方法準(zhǔn)確、可行;對其進(jìn)行加標(biāo)回收實驗的結(jié)果得出川芎嗪的平均回收率達(dá)到100.01%,阿魏酸的平均回收率99.85%,表明樣品的前處理方法符合要求。該方法操作簡便快捷,重復(fù)性、穩(wěn)定性好,結(jié)果可靠準(zhǔn)確。本方法與LC/MS和GC/MS分析方法相比需要的儀器設(shè)備簡單、檢測成本低、對操作人員要求不高,可作為食醋質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)檢測的參考。

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Simultaneous determination of tetramethylpyrazine and ferulic acid in vinegar by HPLC

LI Jian-long1,LIU Shu-liang1,*,PENG Yang1,LIU Jun2,YANG Yong3,HAN Xin-feng1,HOU Xiao-yan1,XIA Xiao-long1,LUO Pei-wen1,JIA Qiu-si1

(1.College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China;2.Colledge of Biology Engineering Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China;3.Sichuan Baoning Vinegar Co.,Ltd.,Langzhong 645000,China)

This paper established a method for simultaneous determination of tetramethylpyrazine and ferulic acid in vinegar by HPLC. The analysis was performed on a Sepax GP-C18column with 35℃;the mobile phase was methanol-water(containing 0.2 % acetic acid)(23∶77,v/v);the detection wave length was 310nm;injection volume 10μL;the flow rate of gradient elution was 1.0mL/min. Results showed that good linearity was obtained over the range of 1.0 to 60.0μg/mL(R2=0.990)for tetramethylpyrazine and 1.0 to 15.0μg/mL(R2=0.997). The retention time of tetramethylpyrazine and Ferulic acid was 14.71 and 19.45min respectively,the average recovery was 100.01% and 99.85% respectively. This method was rapid,sensitive and the sample preparation was simple,so it could be applied to the determination of tetramethylpyrazine and ferulic acid in vinegar products.

HPLC;ferulic acid;tetramethylpyrazine;vinegar

2014-08-07

李建龍(1987-)，男，碩士研究生，研究方向：食品微生物。

*通訊作者:劉書亮(1968-)，男，博士，教授，主要從事食品微生物與發(fā)酵工程研究。

四川省科技廳科技支撐計劃(2013NZ0055)。

TS207.3

A

:1002-0306(2015)09-0287-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.054