高效液相色譜法檢測(cè)大鼠腦內(nèi)肌肽含量

趙善志，李佳恒，吳潤(rùn)蕊，李炎，杜佳睿，王麟冉，趙艷

(錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000)

肌肽是一種由內(nèi)源性β-丙氨酸和L-組氨酸組成的水溶性二肽，在哺乳動(dòng)物易興奮的組織如肌肉和大腦中高濃度存在。肌肽已被證明參與不同的細(xì)胞防御機(jī)制，包括抑制蛋白質(zhì)交聯(lián)、活性氧和氮類解毒以及對(duì)抗炎癥。在許多與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)的疾病中起著關(guān)鍵作用，如動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病[1]。越來(lái)越多的研究表明肌肽能夠明顯改善阿爾茲海默癥[2]、帕金森癥[3]、糖尿病及其并發(fā)癥[4]，腦內(nèi)肌肽濃度與這些疾病密切相關(guān)。但腦內(nèi)肌肽濃度是如何調(diào)節(jié)的仍不確定[5]，因此檢測(cè)腦內(nèi)肌肽含量具有重要意義。本文采用2，4-二硝基氟苯作為衍生試劑，建立了反相高效液相色譜法檢測(cè)大鼠腦內(nèi)肌肽含量的方法，為研究生物體內(nèi)肌肽的變化規(guī)律提供了行之有效的借鑒。

1 儀器與材料

1.1 儀器

日本島津LC-10Avp高效液相色譜儀(包括泵、柱溫箱、紫外檢測(cè)器)；德國(guó)Sigma 2-16PK冷凍離心機(jī)；JY92-Ⅱ型超聲波粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所)；PS-20A超聲波清洗器(上海煜南儀器有限公司)；TJ-600電熱恒溫水箱(江蘇同君儀器科技有限公司)。

1.2 試劑與動(dòng)物

肌肽標(biāo)準(zhǔn)品(98.0%)、2，4-二硝基氟苯為Sigma公司產(chǎn)品；乙腈、三氟乙酸為色譜純；醋酸、醋酸鈉、硼酸、硼砂均為國(guó)產(chǎn)分析純。SD大鼠，體重250～300 g，雌雄各半，由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方 法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的配制

肌肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：稱取肌肽標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加雙蒸水稀釋至100 mL，即得50 mg/L肌肽對(duì)照品貯備溶液。將肌肽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用水分別稀釋至10 mL容量瓶，配制成含肌肽質(zhì)量濃度分別為20.00、10.00、5.00、2.50 mg/L及1.25 mg/L的肌肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液；大鼠腦組織供試品溶液的制備[6]：稱取大鼠腦組織30～50 mg，放入適量的燒杯中，加雙蒸水1 mL后，用超聲粉碎機(jī)粉碎。超聲15次，每次5 s，間隔5 s，功率200 W。然后加入三氟乙酸10 μL，旋渦混勻后，4 ℃離心15 min，15 000 rpm，取出上清，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

2.2 硼酸-硼砂緩沖溶液的制備

將0.2 moL/L的硼酸溶液和0.05 moL/L的硼砂溶液按體積比1∶4混合配制得 pH為9的硼酸-硼砂緩沖溶液。

2.3 空白對(duì)照品溶液的衍生化[7]

取雙蒸餾水1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，分別加入硼酸-硼砂緩沖溶液 5 mL、2，4-二硝基氟苯 0.5 mg，混勻后放入水浴箱中100 ℃水浴1 h，室溫中冷卻后，用硼酸-硼砂緩沖溶液定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的衍生化[7]376-378

分別精密稱取肌肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液 1.0 mL置于10 mL量瓶中，分別加入硼酸-硼砂緩沖鹽溶液 5 mL、2，4-二硝基氟苯 0.5 mg，混勻后放入水浴箱中100 ℃水浴1 h，室溫中冷卻后，用硼酸-硼砂緩沖溶液定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即得。

2.5 高效液相色譜分析條件[7]376-378

色譜柱：Kromail C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.15 moL/L醋酸鈉緩沖溶液(1∶5，V∶V)；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。

3 結(jié)果與分析

3.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

在流動(dòng)相優(yōu)化過(guò)程中，考察了甲醇-水、乙腈-水兩個(gè)流動(dòng)相體系，結(jié)果乙腈-水的分離效果較好，避免了衍生試劑峰的影響，把水換成醋酸鈉緩沖液并且調(diào)整比例后，又更好地改善了肌肽峰的拖尾現(xiàn)象。因此選擇用乙腈-0.15 moL/L醋酸鈉緩沖溶液(1∶5，V∶V)作為流動(dòng)相。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化

查閱文獻(xiàn)，將肌肽標(biāo)準(zhǔn)品與2，4-二硝基氟苯衍生化后，通過(guò)紫外檢測(cè)器掃描，發(fā)現(xiàn)在360 nm處肌肽衍生物有最大的紫外吸收，靈敏度最高，因此選擇360 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 方法學(xué)的考察

3.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取肌肽對(duì)照品溶液與供試品溶液按“2.4”方法衍生化后，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，按照“2.5”的色譜條件各進(jìn)樣10 μL分析，考察衍生試劑峰是否干擾肌肽的檢測(cè)。結(jié)果顯示衍生試劑峰與肌肽峰之間分離度大于 1.5，且色譜峰峰形對(duì)稱，理論塔板數(shù)可達(dá)5000，色譜圖見(jiàn)圖1。

色譜峰1、2：2，4-二硝基氟苯；色譜峰3：肌肽圖1 空白對(duì)照品高效液相色譜圖(A)，肌肽標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖(B)，供試品高效液相色譜圖(C)

3.3.2 線性關(guān)系考查 取20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 mg/L的肌肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照“2.4”方法衍生化后，分別精密量取10 μL，按照“2.5”的色譜條件檢測(cè)，以肌肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(X)與相應(yīng)的峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得回歸方程為：Y=413.55X-25，R2=0.9994。說(shuō)明肌肽在1.25～20.00 mg/L范圍內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好。

3.3.3 精密度試驗(yàn) 取5.00 mg/L的肌肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液衍生化后，按“2.5”的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算肌肽衍生物峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果RSD為 1.27%。

3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取5份大鼠腦組織，按照“2.1”方法平行制備肌肽供試品溶液5 份，衍生化反應(yīng)后按“2.5”的色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果大鼠腦組織肌肽含量的RSD為1.88%。

3.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液3份，分別衍生化反應(yīng)后于室溫下放置，精密吸取10 μL，于 0、6、12、24 h按“2.5”條色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果測(cè)得衍生物峰面積的RSD為0.99%，表明供試品溶液衍生反應(yīng)后于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定肌肽含量的供試品溶液9份，分別準(zhǔn)確加入肌肽對(duì)照品，分三個(gè)添加水平各制備3份，衍生化反應(yīng)后按“2.5”的色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，計(jì)算加標(biāo)回收率。本方法的加標(biāo)回收率在94.1%～100.4%之間，見(jiàn)表1。

3.4 大鼠腦組織中肌肽含量的檢測(cè)

分別取大鼠的大腦皮層和海馬組織30～50 mg，按“2.1”方法制備供試品溶液，按照“2.4”方法衍生化反應(yīng)后，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，各進(jìn)樣10 μL，按“2.5”條色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算肌肽含量，見(jiàn)表2。

表1 肌肽加標(biāo)回收率(n=3)

表2 大鼠腦組織中肌肽含量的檢測(cè)

4 討 論

目前肌肽的檢測(cè)尚無(wú)國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。文獻(xiàn)報(bào)道，肌肽含量測(cè)定有離子交換色譜法[8]、HPLC法[9]及毛細(xì)管電泳法[10]，但毛細(xì)管電泳法對(duì)樣品分離純化要求較高，緩沖體系的pH值較難控制，重現(xiàn)性差。HPLC法測(cè)定肌肽含量有采用熒光檢測(cè)器測(cè)定，但由于紫外檢測(cè)器比較容易獲得，所以本文采用2，4-二硝基氟苯對(duì)肌肽進(jìn)行了衍生化反應(yīng)，選用Kromail C18反相色譜柱、紫外檢測(cè)器來(lái)測(cè)定肌肽含量。本方法成本較低、易于實(shí)現(xiàn)，而且穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及分離度均較好，為進(jìn)一步研究肌肽在生物體內(nèi)的變化規(guī)律提供了行之有效的檢測(cè)方法。