烏骨雞快慢羽的ev21和dSPEF2/dPRLR分子標記檢測

王歡歡，宋丹丹，葛 瑩，張 雷，李慶海，章學東

(杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310024)

雞的羽毛長速(羽速)有快羽和慢羽之分，主要是指翼羽和尾羽等長出速度的快慢?？煊鸹蚵鹪陔r雞出殼后即可看出：快羽雞其主翼羽顯著長于覆主翼羽；而慢羽雞的主翼羽等于或短于覆主翼羽。研究表明，快慢羽屬于伴性遺傳性狀，受Z染色體上的一對等位基因(k或K)所控制?？煊?k)相對于慢羽(K)為隱性，因此，用快羽公雞(ZkZk)配慢羽母雞(ZKW)，后代公雛表現(xiàn)慢羽(ZKZk)，母雛表現(xiàn)快羽(ZkW)，從而能實現(xiàn)雛雞的自別雌雄[1,2]。

據(jù)研究，慢羽K基因通常攜帶有插入的內(nèi)源性病毒基因21(ev21基因)，但也有少數(shù)慢羽雞種不存在ev21基因插入。同時，慢羽K基因還可能包含由SPEF2基因和PRLR基因的非編碼區(qū)融合組成的重復片段(dSPEF2/dPRLR基因)[3-5]。ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因均為快慢羽研究的重要候選基因，因此，本試驗開展了烏骨雞群體的快慢羽分型以及ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因的檢測，通過了解烏骨雞的快慢羽分子結構特點，為烏骨雞的新品系培育提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗材料 選擇了由杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院保存的HW1系黑羽烏骨雞，在1日齡時，對756羽健康雛雞進行羽速觀察，區(qū)分快羽和慢羽雞并佩戴相應翅號。

1.2樣品采集與DNA提取 在90日齡時，采集快羽和慢羽雞各40羽的翅靜脈血液。按照Axygen動物血液DNA試劑盒說明書提取雞血液基因組DNA，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。

1.3擴增引物 參考Takenouchi[5]文獻分別設計用于擴增Z染色體上ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因的引物。引物交由杭州擎科梓熙生物技術有限公司合成。

1.4雙重PCR反應 PCR反應體系為：DNA 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，F(xiàn)、IN、R引物分別為0.5 μL、0.3 μL、0.3 μL，加水補至 25 μL。上ABI 9700型PCR儀(ABI，美國)進行擴增。ev21基因的PCR反應程序為：94℃，5 min；然后進入PCR循環(huán)，94℃，30 s，57℃，30 s，72℃，30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。dSPEF2/dPRLR基因的PCR反應程序為：94℃，5 min；然后進入PCR循環(huán)，94℃，30 s，55℃，2 min，72℃，30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)拍照。

表1 引物信息

2 結果與分析

2.1烏骨雞雛雞快慢羽分型 在1日齡時，對756羽健康雛雞進行羽速觀察結果顯示：HW1系烏骨雞的快羽和慢羽雞比例分別為72.2%和27.8%。慢羽中存在倒長型、未長出型和等長型三種類型，其中等長型比例最高，未長出型比例小于5%。

注：A快羽型，B倒長型，C未長出型，D等長型圖1 雛雞快慢羽鑒別情況

2.2烏骨雞ev21基因插入檢測 ev21基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳后，慢羽烏骨雞樣本有ev21片段插入出現(xiàn)396 bp和341 bp兩條帶，快羽烏骨雞僅出現(xiàn)396 bp一條帶。

1、2、3為慢羽雞，4、5、6為快羽雞，M為DL2000標志物圖2 ev21基因插入檢測

2.3烏骨雞dSPEF2/dPRLR融合基因檢測 dSPEF2/dPRLR基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳后，慢羽烏骨雞樣本出現(xiàn)1950 bp和1437 bp兩條帶，即慢羽烏骨雞Z染色體上有dSPEF2/dPRLR融合基因片段，而快羽烏骨雞僅出現(xiàn)1950 bp一條帶，無融合基因片段插入。

1、2、3為慢羽雞，4、5、6為快羽雞，M為DL2000標志物圖3 dSPEF2/dPRLR融合基因插入檢測

2.4基因分型與鑒雛分型的一致性 40羽快羽雞和40羽慢羽雞的ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因PCR分型結果與出雛時的羽速觀察分型結果基本一致，僅有1羽慢羽雞的Z染色體上沒有檢測到ev21位點插入。

表2 出雛判斷與基因檢測對照表

3 討論與結論

Bacon[6]在DNA水平上證實了慢羽基因K與內(nèi)源性病毒ev21緊密連鎖，并認為ev21的插入，造成雛雞羽毛生長速度緩慢。但Boulliou等[7]在商品蛋雞的快慢羽基因型研究結果表明ev21座位不是決定慢羽表型的唯一因素。Elferink等[2]研究表明慢羽雞的K基因還包含PRLR和SPEF2 及其部分重復的 dPRLR和dSPEF2基因。Takenouchi等[5]對52個雞種開展研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的快羽雞中都沒有ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因；除了Ingie品種慢羽雞中沒有ev21基因插入，其余慢羽雞Z染色體上都檢測到ev21和dSPEF2/dPRLR基因。本實驗中，烏骨雞快羽樣品都沒有檢測到ev21和dSPEF2/dPRLR基因，這與多數(shù)快羽雞種的結果一致。dSPEF2/dPRLR基因是PRLR基因的第1-11外顯子、第12外顯子的558 bp處和SPEF2基因的第1-5外顯子重復拼接形成[3,8]。Bu等[9]研究認為PRLR有多個啟動子，慢羽雞中表達的dPRLR比正常的PRLR蛋白在尾部少149個氨基酸。在小鼠中研究表明，敲除PRLR基因小鼠可改變毛發(fā)生長周期，敲除小鼠毛發(fā)比野生型的毛發(fā)稍長且較粗。這些發(fā)現(xiàn)表明PRLR對毛發(fā)周期具有抑制作用[10]。趙計昌研究發(fā)現(xiàn)融合基因或dPRLR僅在慢羽雞中轉錄表達。SPEF2基因在慢羽雞皮膚組織中的表達量顯著高于快羽雞[11]。本研究在慢羽雞Z染色體上均檢測到dSPEF2/dPRLR基因，也顯示了烏骨雞dSPEF2/dPRLR基因與慢羽性狀連鎖更緊密。

目前，在國外引進的海蘭、羅曼和白來航雞等商品雞種中已廣泛采用快慢羽配套系，占據(jù)了蛋(肉)雞的主流市場。國內(nèi)也有一些研究機構或公司開展了地方品種快慢羽系的選育以及配套雜交。本試驗結果表明，HW1系烏骨雞中存在快慢羽性狀，慢羽雞的K基因上同時含有ev21插入基因和融合基因dSPEF2/dPRLR。因此，在烏骨雞快慢羽新品系的開發(fā)中，可以利用ev21和dSPEF2/dPRLR基因檢測等分子方法來輔助選育，提高準確性，加快育種進程。