圈養(yǎng)華南虎血常規(guī)正常參考值的初步研究

李石洲 袁耀華 任小冬 陳大慶 雷勝橋 李秋明

(1.廣東粵北華南虎省級自然保護區(qū)管理處，韶關，512023；2.上海動物園；上海，200335；3.蘇州動物園，蘇州，215000)

華南虎(Pantheratigrisamoyensis)為中國特有的虎亞種，野外已多年未發(fā)現其蹤跡，現存華南虎均為20世紀50—60年代捕獲的6只華南虎的后代[1]?，F存華南虎分別飼養(yǎng)于國內各動物園和繁育基地，近親繁殖造成的遺傳多樣性缺失已不可避免，母虎的受孕率與幼虎成活率極不穩(wěn)定，且現存活的華南虎中出現疾病多樣化趨勢。由于華南虎種群小、血液樣品采集困難，華南虎血液方面研究較少，可查資料不多，僅發(fā)現數篇報道有關華南虎血液指標。目前可查資料顯示華南虎血常規(guī)指標的研究數據各有差異，不利于華南虎的疾病診斷和健康狀況評估。動物血液指標是反映動物機體狀況的重要指標，是動物疾病臨床診斷和治療的重要依據[2]。本研究從國內僅存約160只華南虎中選取部分健康的華南虎作為研究對象，采集血樣對華南虎血常規(guī)各項指標進行測定和分析，形成華南虎血常規(guī)正常參考值范圍，為華南虎飼養(yǎng)管理、疾病防治和保育繁殖等提供科學參考，幫助華南虎種群健康發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本項目的研究對象為華南虎的血液，在全國人工圈養(yǎng)的華南虎中選擇部分健康華南虎采集血液樣本，血樣標本制備時華南虎為空腹12 h以上。成年虎在舒泰+哆咪靜的復合麻醉狀態(tài)下從其后肢或尾部靜脈穿刺采血，有小部分樣本是在治療夾籠控制下從尾部靜脈穿刺采血，幼年虎捕捉后強制在其后肢靜脈穿刺采血。檢測時血清標本清晰，無溶血現象方為有效樣本。把華南虎血采集在盛有抗凝劑(K3 EDTA或K2 EDTA)真空采血試管中用作血細胞分析(血常規(guī))。血樣采集后需要輕輕搖勻幾次，使抗凝劑與血液混勻，放置15—20 min，并在15 min到4 h內測試，最佳測試時間為30 min到2 h。如需要運輸，需在2—8 ℃密封條件下進行。由于華南虎為大型食肉類貓科動物，血液樣本采集困難，2014—2017年僅采集到36只華南虎血樣，有效樣本30份，無效樣本6份。經檢測得到血常規(guī)檢測報告30份，年齡性別信息見表1。

表1 有效樣本的年齡和性別統(tǒng)計

Tab.1 Age and gender statistics for valid samples

1.2 研究設備材料和方法

主要儀器和耗材有：美國Hemavet 950 FS 獸用全自動血液細胞分析儀；配套的試劑盒(Hemavet 950 FS專用試劑包)；真空采血管-抗凝劑(K3 EDTA或K2 EDTA)、一次性采血器；電動推剪、刮毛刀等。考慮到華南虎分布在全國各地，血液采集后有效保存時間較短，空運受到限制，其他運輸方式都無法確保血樣及時送達實驗室。因此，本項目分別在上海動物園、廣州動物園設立血液檢測實驗室。秉著使本次試驗的誤差最小化原則，兩家實驗室均使用同一品牌、同一型號的儀器對樣本進行檢測。該血液細胞分析儀采用電阻抗法和射頻技術，具有全自動處理和強大的軟件數據管理系統(tǒng)，能確保獲得精確的分析結果。該設備采用的聚焦流專利技術，使鞘液形成渦流，包裹在樣品流周圍，然后使細胞按直線逐個通過記數孔，有效地避免了計數過程中血細胞的再次循環(huán)、重疊產生的不正確脈沖，大大提高了記數的準確性，保證獲得精確的結果。

1.3 血常規(guī)的數據統(tǒng)計和參考值范圍的計算方法

應用SPSS 20軟件對所有數據進行統(tǒng)計分析。應用Kolmogorov-Smirnov對所有血常規(guī)數據進行正態(tài)性檢驗，同時計算出所有指標的平均值、標準差、Kolmogorov-SmirnovZ值、漸近顯著性(雙側)P值等。計算參考值范圍的方法有多種，其中最基本的有正態(tài)分布法和百分位數法[3]。表1給出了兩種方法90%、95%、99% 3種概率作為參考區(qū)間的計算公式[4]。2種方法比較，百分位數法適合于任何分布類型的資料，故在實際中最為常用，但由于參考值范圍所涉及的常常是波動較大的兩端數據，使用百分位數法必須要有較大的樣本含量，否則結果很不穩(wěn)定；正態(tài)分布法要求資料必須服從或近似服從正態(tài)分布，優(yōu)點是結果比較穩(wěn)定，在樣本量不是很大的情況下仍然能夠進行處理，缺點是適用范圍較窄，不適合偏態(tài)分布的數據資料[4]。

2 結果

2.1 血常規(guī)各項指標的統(tǒng)計及正常值范圍

本研究共收集血常規(guī)檢驗報告30份，檢驗時間為2014—2017年。白細胞和紅細胞、血紅蛋白、血小板等主要項目的數據達到30個，具備一定的統(tǒng)計學意義。綜合考量華南虎種群數量和本次實驗的實際情況后，認為95%的概率范圍能較好地兼顧可信度和精確度，故本文中的醫(yī)學參考值范圍取95%的概率為正常值參考區(qū)間。華南虎血常規(guī)各項統(tǒng)計參數及正常值范圍見表3。

2.2 血常規(guī)指標分析

對血常規(guī)各項指標的數據分布進行正態(tài)性檢驗。符合正態(tài)分布項的血常規(guī)指標正常參考值范圍采用正態(tài)分布法95%概率的公式計算(表2)。經檢驗，血小板計數和嗜堿性粒細胞數兩項指標不符合正態(tài)分布(P<0.05)，用百分位數法取95%概率計算血小板計數和嗜堿性粒細胞數的正常參考值范圍(表3)。

表2 醫(yī)學參考值范圍的正態(tài)分布法和百分位數法計算公式[4]

Tab.2 Formulas of normal distribution method and percentile method for calculating the range of medical reference values

注：X^表示均值，S表示標準差，Pm表示第m百分位數

Note：X^is the mean value，Sis the standard deviation，Pmstands for them-th percentile

表3 華南虎血常規(guī)各項統(tǒng)計參數及正常值范圍

Tab.3 Statistical parameters and normal range of blood routine of South China tiger

注：X^表示均值，S表示標準差；**漸近顯著性(雙側)即為正態(tài)性檢驗中P值

Note：X^is the mean value，Sis the standard deviation.**The asymptotical significance(both sides)isP

2.3 差異性分析

研究血常規(guī)指標，必須進行年齡、性別等各種影響因素的差異性分析。我們采用單因素方差分析方法，對年齡、性別兩組進行組間差異顯著性分析。如按性別分組后雌雄比例為13∶17，假設各項指標組間差異不顯著進行獨立樣本t檢驗，結果顯示，各項血常規(guī)指標的差異顯著性均大于0.05，證明假設成立，即華南虎血常規(guī)雌、雄兩組差異不顯著。按年齡分組，幼齡組與成年組比例為14∶16，假設各項指標組間差異不顯著進行獨立樣本t檢驗，組間檢驗各項血常規(guī)指標的Sig值均大于0.05，證明假設成立，即華南虎血常規(guī)幼齡組與成年組差異不顯著。因此，不同性別、年齡間華南虎血常規(guī)各項指標差異不顯著。

3 討論

3.1 技術方法比較

目前，國內外對虎的血液指標研究較少，技術方法也各有不同。如張錫然等[5]關于東北虎(Pantheratigrisaltaica)和華南虎血象測定使用的血球計數板和光電比色法，檢測血常規(guī)指標8項；凌明德等[6]關于華南虎血常規(guī)測定使用也是血球計數板和光電比色法，檢測血常規(guī)指標9項；阿布力孜·阿布力米提等[7]關于東北虎和孟加拉白虎(Pantheratigristigris)的血常規(guī)指標，檢測項目達18項。本文使用全自動(獸用)血液細胞分析儀，采用電阻抗法和射頻技術，本項目檢測血常規(guī)指標共23項，較全面地對華南虎血常規(guī)指標進行了測定。較早期華南虎血常規(guī)的檢驗主要依靠手工計數等方法，在實驗過程中存在較多可能產生誤差的步驟，隨著技術的發(fā)展，現大多數儀器均能做到全自動分析結果，減少了手工計數等可能產生誤差的環(huán)節(jié)，保證了檢驗結果的精確性。

3.2 條件假設和誤差控制

影響血常規(guī)檢驗的主要因素可歸納為人為因素、生理因素、儀器因素、試劑因素等幾個方面，這些方面分別在檢驗的不同階段影響結果[8]。在華南虎的血常規(guī)檢驗中，這些影響因素同樣存在，還有更多影響因素不能忽視。如華南虎難以控制采血，各地飼養(yǎng)條件等不同，可供研究的樣本量極少。所以我們把從外觀、行為等比較正常且無明顯疾病的華南虎都暫認為其是正常的。因此，在影響被研究指標主要的可控制因素達到相同或基本相同就認為是同質，本文假設所有參加實驗的華南虎都是在同質的條件下進行的。在本文所述研究中，通過人員培訓、控制檢測程序等措施，來減少各種因素對檢驗結果的影響。血小板的主要生理功能是參與凝血和止血，表2中血小板的漸近顯著性(雙側)為0.033，不符合正態(tài)分布，且與張錫然等[5]、凌明德等[6]報道的參數有一定差別，這種差別產生的原因可能是采血方式、測定方法、華南虎飼養(yǎng)條件等不同而造成。本文按已得數據計算血小板的正常值范圍，對血小板的影響因素需要進行進一步研究。

3.3 華南虎血常規(guī)的比較

由于華南虎血常規(guī)指標的研究較少，本文將2篇華南虎血液指標相關論文中的數據進行部分比較。張錫然等[5]測定部分項目的均值和范圍分別為白細胞8.73(5.5—19.0)103/mL、紅細胞652.30(443—769)104/mL、血小板13.40(6.2—32.0)104/mL、血紅蛋白12.68(11.3—14.0)g/mL，與本文所得結果有一定的差別，可能是檢測方法、儀器、華南虎飼養(yǎng)條件等與現在有很大的不同，造成一定的差別。凌銘德等[6]測定的白細胞計數(5.8—28.2)109/L，其范圍明顯大于本研究的白細胞計數范圍(8.54—23.77)109/L，但其雌性、雄性、幼虎的均值分別為11.75×109/L、11.95×109/L、13.89×109/L，與本文得到的均值12.19×109/L較為接近，其中大部分項目與本文中統(tǒng)計結果相近。

3.4 其他虎亞種相關研究結果比對與討論

為研究華南虎與其他虎亞種在血常規(guī)各項指標之間有無差異，本文對已有的關于孟加拉虎、東北虎、白虎的血常規(guī)指標進行了對比分析。張錫然等[5]測定東北虎的部分血常規(guī)指標的均值和范圍分別為白細胞8.92(4.0—14.0)103/mL、紅細胞683.8(530—940)104/mL、血小板15.67(6.2—39.8)104/mL、血紅蛋白12.99(9.5—19.7)g/mL等，與本文所得結果差別不大。阿布力孜·阿布力米提等[7]測定東北虎和孟加拉白虎的血常規(guī)各項指標的均值和標準差與本文結果均存在較大差別，可能與該文選取的虎均為幼虎有一定關系，但其所述范圍均在本文所得正常值范圍內。張紅緒等[9]測定的東北虎幼體白細胞(16.59±2.74)109/L、紅細胞(6.82±0.60)1012/L、血紅蛋白(118.92±17.24)g/L、血小板(415.38±71.51)109/L，其白細胞均值明顯大于本研究的(12.19±3.44)109/L，紅細胞均值小于本文的(8.08±1.09)1012/L，血紅蛋白均值也明顯小于本文(144.50±21.57)g/L，血小板均值大于本文的(369.83±632.35)109/L。而Shrivatav等[10]報道孟加拉虎部分血常規(guī)的范圍和平均值為：白細胞(6.2—11.05)、(8.5±1.49)103/μL，紅細胞(4.66—9.15)、(7.9±1.42)106/μL；血紅蛋白(7.8—13.8)、(12.8±1.65)g/dL等，其紅細胞的范圍和平均值與本文結果近似，但白細胞、血紅蛋白的均值和范圍都明顯小于本文所得結果。由此發(fā)現，華南虎與其他虎亞種血常規(guī)的各項指標存在一定差別。華南虎血常規(guī)指標正常參考值范圍不同于其他虎亞種，建立華南虎血常規(guī)指標正常值對華南虎的飼養(yǎng)管理、疾病診治預防和保育繁殖研究工作很有必要。

致謝：本文血液檢測由上海動物園和廣州動物園完成；上海、廣州、蘇州、南昌動物園等提供華南虎血液標本；除本項目參加人員外，南昌動物園黃薇、韶關華南虎基地劉力軍等對本項目給予了大力支持，在此一并感謝。