鹿茸多肽的研究進(jìn)展

王 響 鞠貴春

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春，130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春，130118)

鹿全身是寶，鹿茸、鹿角、鹿胎、鹿骨、鹿鞭、鹿血等均是《本草綱目》與民間驗(yàn)方有記載的可供藥用的名貴中藥材和食療補(bǔ)品。尤其是鹿茸有明顯改善人體機(jī)能的功效，被列為動(dòng)物藥之首?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中曾有記載“味甘溫，主漏下惡血，益氣強(qiáng)治補(bǔ)血之功，補(bǔ)腎之效?！薄侗静菥V目》中亦有記載“補(bǔ)腎壯陽，生精益血，補(bǔ)髓健骨”。我國(guó)對(duì)鹿茸的研究具有悠久的歷史，很早之前，人們對(duì)鹿茸的藥理作用不斷地進(jìn)行探討，對(duì)鹿茸的多種藥理活性成分進(jìn)行了分離，確定了鹿茸中含有蛋白多肽、甾體化合物、無機(jī)元素、多糖、脂肪酸、磷脂、胺類、生物堿和脂多糖等多種有效成分[1]，其中鹿茸多肽類物質(zhì)含量在50%以上，包含多種生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)人體多種生長(zhǎng)因子分泌，對(duì)人體的一些生理功能具有調(diào)節(jié)作用，具有顯著的藥理作用和保健功效。

1 鹿茸多肽的研究現(xiàn)狀

趙麗莉[2]利用Alcalase AF 2.4L堿性蛋白酶酶解馬鹿茸生成多肽，并且通過不斷優(yōu)化酶解條件從而選取出馬鹿茸酶解的最佳工藝。采用Tricine凝膠系統(tǒng)對(duì)馬鹿茸酶解后多肽分布進(jìn)行分析，得出結(jié)論：馬鹿茸酶解前分子量主要分布在10—75 kDa，馬鹿茸酶解后分子量主要分布在5—2 kDa。郝林琳[3]從新鮮馬鹿茸中提取活性多膚，SDS-PAGE顯示其為一系列分子量低于17 kDa多肽混合物，檢測(cè)到其含有IGF-1、EGF、NGF等生長(zhǎng)因子。Zhang等[4]從梅花鹿茸中提取出一種分子量為7.2 kDa，由68個(gè)氨基酸組成的水溶性多肽活性物質(zhì)，具有刺激軟骨生長(zhǎng)，成骨樣細(xì)胞增殖的作用?？吕罹У萚5]從梅花鹿鹿茸中分離出分子量為153 kDa，能夠促進(jìn)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)活性的鹿茸多肽。段冷昕[6]從馬鹿茸中分離出一種分子量為3.2 kDa的單體多肽，由32個(gè)氨基酸殘基組成，又稱為32肽，其中含量最多的氨基酸分別為纈氨酸，賴氨酸、甘氨酸和丙氨酸，具有抑制細(xì)胞內(nèi)IL-6，IL-1因子的功能。

2 鹿茸多肽的提取方法

鹿茸多肽的提取方法有很多種，常用的提取方法主要有以下幾種。

2.1 有機(jī)溶劑萃取法

在中藥提取方面，是最常用的方法，通常采用乙醇、丙酮、乙醚、石油醚、苯、氯仿等有機(jī)溶劑提取。本方法的優(yōu)點(diǎn)是毒副作用小，溶劑易獲得，成本低，回收方便。缺點(diǎn)是有機(jī)溶劑對(duì)鹿茸多肽活性具有一定的破壞作用。有機(jī)溶劑熔點(diǎn)低、易燃，操作過程對(duì)溫度要求嚴(yán)格，控制難度較大，本方法可將鹿茸提出物分為鹿茸多肽組分Ⅰ和組分Ⅱ，這兩種組分均具有抗炎和促生長(zhǎng)的作用[7]。

2.2 CO2超臨界萃取法

本方法利用減壓和變溫使提取物分離出來，無須回收溶劑，節(jié)約能耗，操作簡(jiǎn)單，成本低，可循環(huán)利用。但是隨著萃取化合物的極性基團(tuán)增多，萃取難度加大，化合物的相對(duì)分子質(zhì)量越高，萃取難度也增大。在鹿茸提取上具體就是將鹿茸冷凍后干燥，用粉碎機(jī)粉碎過篩，提取鹿茸多肽時(shí)，首先將鹿茸冷凍干燥，粉碎過篩后放入CO2超臨界萃取。在萃取壓力35 MPa，萃取溫度40 ℃以下時(shí)蛋白質(zhì)的萃取率可達(dá)130.73 mg/g[8]。

2.3 酶解提取法

本法可彌補(bǔ)有機(jī)溶劑萃取法的不足，解決了低溫控制難的問題，提取的鹿茸多肽活性高、純度好。將鹿茸冷凍干燥，粉碎后加入鹽酸胍和胃蛋白酶抑制劑浸提，離心取上清液，加入硫酸銨進(jìn)行蛋白梯度鹽析，離心后的沉淀物進(jìn)行復(fù)性，用透析袋截留，冷凍干燥后得到水溶性蛋白，然后利用胃蛋白酶、胰酶、氫氧化鈉和鹽酸溶液調(diào)節(jié)酶的pH，獲得不同分子量的鹿茸蛋白水解肽，采用的酶不同，鹿茸多肽獲得率也不同[9]。

2.4 Tris-Hcl法提取法

將鹿茸鮮品剃毛切薄片，沖洗后稱重，反復(fù)勻漿，勻漿過程中不斷添加勻漿液(Tris-Hcl緩沖溶液，pH 8.0)，4 ℃條件下離心后取上清液。除鹽后凍干，得到鹿茸蛋白質(zhì)粗提物，在-20 ℃保存。緩沖液pH值、溫度與提取時(shí)間影響提取率。此提取方法簡(jiǎn)單易操作，節(jié)省時(shí)間，成本低，但pH值易受溫度影響[10]。

2.5 超聲波提取法

通常以水、醋酸緩沖溶液、堿性碳酸鹽緩沖溶液或磷酸緩沖溶液為溶劑，將鮮鹿茸洗凈、去毛、切片、粉碎后脫脂，根據(jù)不同需要加入不同的提取液，在特定溫度下超聲浸提一定時(shí)間，然后離心取上清液，透析后冷凍干燥。此提取方法的優(yōu)點(diǎn)是操作時(shí)間短，成本低，操作簡(jiǎn)單安全性高，可有效提高鹿茸多肽的提取率[11]。

2.6 高壓電場(chǎng)法提取法

利用分子在高壓電場(chǎng)條件下產(chǎn)生極化反應(yīng)，利用電場(chǎng)瞬間高強(qiáng)度的脈沖來破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來。姜薇等[12]利用高壓脈沖電場(chǎng)輔助菠蘿蛋白酶制備鹿茸抗氧化肽，并進(jìn)行了分離純化。此提取方法常溫提取，耗時(shí)短，可最大限度地保留鹿茸多肽的生物活性，節(jié)能無污染。

2.7 勻漿法

取新鮮鹿茸洗凈后切塊粉碎，浸泡沖洗至無色，用預(yù)先放于層析柜(4 ℃)中冷卻加入預(yù)冷的勻漿液(冰醋酸溶液)，膠體磨勻漿，間隔一定的時(shí)間吸取混合勻漿液，在4 ℃條件下，轉(zhuǎn)速離心后吸取上清液，放入透析袋中透析脫鹽，定時(shí)更換透析液并測(cè)量pH，直至pH為中性停止透析，透析袋內(nèi)液體為所需蛋白。此提取方法的優(yōu)點(diǎn)是隨著勻漿時(shí)間的增加，鹿茸多肽的濃度增加。但是與超生提取法相比，耗時(shí)較長(zhǎng)[13]。

3 鹿茸多肽的藥理作用

3.1 對(duì)骨骼的藥理作用

劉繼華等[14]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)骨折小鼠注射鹿茸多肽會(huì)使小鼠骨折愈合速度明顯加快，鹿茸多肽使骨髓腔充滿大量骨髓細(xì)胞，骨性連接更加稠密，抗骨折能力增強(qiáng)。李文超等[15]發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽對(duì)白介素-1β誘導(dǎo)的大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞的增殖和基質(zhì)蛋白、基質(zhì)降解酶的基因表達(dá)具有逆轉(zhuǎn)作用。并且能有效地拮抗白介素-1β對(duì)軟骨終板細(xì)胞增殖的抑制作用，上升Ⅱ型膠原蛋白基因的表達(dá)，下調(diào)Ⅹ型膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-13基因的表達(dá)具有延緩椎間盤軟骨終板退變的作用。Zhang等[16]研究證實(shí)馬鹿茸多肽顯著逆轉(zhuǎn)了去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松癥，改善了骨重量系數(shù)、骨礦物質(zhì)密度、礦物質(zhì)含量和微結(jié)構(gòu)，抑制了白介素1與白介素6的活化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽還具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞增殖的作用。

3.2 對(duì)心肌細(xì)胞的藥理作用

徐巖等[17]研究表明，鹿茸多肽可促進(jìn)心肌干細(xì)胞基因和心肌肌球蛋白重鏈基因的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)氧化酶的活性，促進(jìn)過氧化物的分解，對(duì)心肌干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞具有促進(jìn)作用?，F(xiàn)代研究表明[18]鹿茸多肽對(duì)大鼠心肌缺血性損傷有保護(hù)作用，在一定劑量范圍內(nèi)可顯著減少因心肌缺血而造成的心肌梗死面積。鹿茸多肽具有提高血清和心肌組織中的超氧化物歧化酶的活性，降低血清中肌酸激酶、乳酸脫氫酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和心肌組織中丙二醛的含量的作用，鹿茸多肽在心肌損傷性疾病的康復(fù)中有比較好的治療價(jià)值。

3.3 抗炎癥作用

炎癥與體內(nèi)血清中的丙二醛，超氧化物歧化酶和炎癥因子NO的含量有關(guān)，鹿茸蛋白水解肽可通過載體運(yùn)輸和旁路運(yùn)轉(zhuǎn)的方式被小腸上皮吸收利用。已有研究證實(shí)[19]：鹿茸多肽可有效抑制腸炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等急慢性炎癥，對(duì)哮喘和動(dòng)脈粥樣硬化也具有抑制作用。Dong等[19]認(rèn)為鹿茸多肽對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞原代培養(yǎng)有積極影響，顯著抑制由脂多糖誘導(dǎo)髓核細(xì)胞而產(chǎn)生的炎癥因子，包括白細(xì)胞介素-1β，腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6。鹿茸肽還會(huì)抑制由脂多糖誘導(dǎo)的丙二醛的增加和超氧化物歧化酶的減少，并且減少脂多糖對(duì)機(jī)體的攻擊，對(duì)抗椎間盤髓核細(xì)胞原代培養(yǎng)中脂多糖介導(dǎo)的炎癥。王昊天[8]采用CO2超臨界提取法和酶解法得到多種分子量不同的多肽，對(duì)抗炎效果進(jìn)行了評(píng)估，認(rèn)為鹿茸肽抗炎效果是多種肽共同作用的結(jié)果。Lee等[20]采用堿性蛋白酶酶解鹿茸粉得到了具有抗機(jī)體炎癥效果的鹿茸多肽，并證實(shí)鹿茸多肽會(huì)抑制炎癥介質(zhì)如一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)。趙磊等[9]研究發(fā)現(xiàn)鹿茸水解蛋白肽更容易被小腸上皮細(xì)胞吸收，并且可顯著降低NO含量，增加血清中超氧化物歧化酶的含量，改善機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，抗炎效果較好。這些研究結(jié)果表明鹿茸多肽可作為具有抗炎作用的潛在天然藥物。

3.4 抗氧化作用

機(jī)體的氧化機(jī)制與機(jī)體的衰老機(jī)制相關(guān)，據(jù)劉春娟[21-22]研究證明，鹿茸多肽增強(qiáng)超氧化物歧化酶活性，清除體內(nèi)過多的氧自由基的作用，在延緩衰老方面有顯著的功效。利用膜分離技術(shù)從鹿茸中分離出不同分子量的多肽并與維生素C為對(duì)照，比較不同分子量的多肽的抗氧化能力，結(jié)果表明分子量在6 214 μ以下的多肽在8.0—10.0 mg/mL的濃度下對(duì)羥基自由基的清除能力和對(duì)脂質(zhì)體氧化抑制的能力明顯高于維生素C。

3.5 抗疲勞作用

已有研究證明[23]鹿茸多肽可提高人體內(nèi)肌糖原和肝糖原的儲(chǔ)備量，或者是減少在運(yùn)動(dòng)過程中體內(nèi)肌糖原和肝糖原的損耗，由此兩種途徑延長(zhǎng)糖在體內(nèi)代謝的時(shí)間從而達(dá)到抗疲勞作用，并且隨著鹿茸多肽劑量的增加，抗疲勞的作用越明顯。

3.6 對(duì)肝臟的藥理作用

肝纖維化是很多肝臟疾病的誘因，肝竇狀毛細(xì)血管化是肝細(xì)胞纖維化過程中的一個(gè)重要的病理改變，鹿茸多肽具有調(diào)解人體肝細(xì)胞，改善肝損傷，提高肝臟功能，從而能夠保護(hù)人體肝臟。鹿茸多肽能夠促進(jìn)肝細(xì)胞再生，修復(fù)肝細(xì)胞損傷[24]。段冷昕[6]利用大鼠肝纖維化模型，觀察發(fā)現(xiàn)鹿茸肽可減輕肝竇毛細(xì)血管化，改善肝臟微循環(huán)，減輕肝纖維化病變，通過提高機(jī)體內(nèi)對(duì)自由基的清除程度，保護(hù)肝臟的細(xì)胞，在肝臟疾病的治療中作用明顯。

3.7 促進(jìn)皮膚創(chuàng)口愈合

在臨床上皮膚創(chuàng)傷常見，包括燒傷、燙傷、劃傷等導(dǎo)致皮膚表面出現(xiàn)破損，鹿茸多肽作為鹿茸含量豐富的活性物質(zhì)，對(duì)人體組織間細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。牛瓊等[25]利用鹿茸多肽治療大鼠背脊創(chuàng)口，發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽可促進(jìn)皮膚創(chuàng)口愈合，作用機(jī)制是促進(jìn)表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的分裂，鹿茸多肽在對(duì)皮膚創(chuàng)口治療過程中外敷給藥的效果要比注射給藥效果顯著。

3.8 對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)作用

Bai等[26]認(rèn)為鹿茸多肽在體外對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞的過程有明顯促進(jìn)作用。Zhang等[4]證明，鹿茸多肽-聚乳酸聚羥基乙酸復(fù)合膜能夠提供神經(jīng)修復(fù)所需要的微環(huán)境，而鹿茸多肽作為其中必不可少的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可促進(jìn)周圍神經(jīng)再生。魏延云等[27]認(rèn)為鹿茸多肽對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷，具有促進(jìn)神經(jīng)再生、加快神經(jīng)軸生長(zhǎng)作用。朱文赫等[28]認(rèn)為鹿茸多肽可對(duì)抗神經(jīng)性藥物對(duì)小鼠記憶的損傷以及微波輻射對(duì)小鼠神經(jīng)細(xì)胞的損傷，對(duì)小鼠的記憶鞏固和記憶修復(fù)有促進(jìn)作用。

3.9 其他作用

徐巖等[29]認(rèn)為鹿茸多肽對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用，二者之間有一定的量效關(guān)系，在腫瘤細(xì)胞的G2/M期阻滯腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。黎同明等[30]研究證明，鹿茸多肽對(duì)生殖系統(tǒng)也有顯著作用，鹿茸多肽可提高雄鼠腺垂體細(xì)胞分泌的黃體生成素和睪酮的含量，對(duì)陽痿和性功能障礙有一定的治療作用。 Zang等[31]研究證實(shí)鹿茸多肽可使老化的雄性小鼠的性功能顯著改善，鹿茸對(duì)性功能的影響是通過促進(jìn)幾種合成睪酮的限速酶的表達(dá)從而促進(jìn)體內(nèi)睪酮合成。Zhu等[32]研究證明從鹿茸中分離出7.0 kDa的多肽可明顯增強(qiáng)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的活力，減少細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位去極化，抑制氧化應(yīng)激，證明了鹿茸多肽在治療心血管疾病的前景。Zhao等[33]證實(shí)鹿茸肽可通過阻斷TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)來防止心臟纖維化，在心臟組織中鹿茸肽具有抗纖維化作用。

4 小結(jié)

我國(guó)目前已經(jīng)具有了較為成熟的鹿養(yǎng)殖和鹿產(chǎn)品加工技術(shù)，多種分離純化方法都能夠提取鹿茸多肽，但是每一種分離提純方法都有一些不足的問題，還需要探索一種更有效、更快速、對(duì)成分活性損傷小的分離純化技術(shù)，在制劑工藝和給藥途徑上還需進(jìn)一步規(guī)范。鹿茸多肽的作用機(jī)理還需要進(jìn)行研究，如何能保證多肽分子在未起作用之前不失活。隨著鹿茸多肽在人類生活中廣泛的應(yīng)用，對(duì)鹿茸多肽類產(chǎn)品質(zhì)量控制方法和毒副作用還需要研究。在藥品用藥安全方面和藥理作用方面還需進(jìn)一步研究。