化學(xué)品生物降解的評(píng)價(jià)方法

羅朝陽(yáng)

（達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川達(dá)州635001）

隨著合成有機(jī)物的生產(chǎn)和使用逐年增加，其大部分不易被分解，殘留在生態(tài)環(huán)境中，對(duì)生態(tài)環(huán)境以及人和動(dòng)植物的生存構(gòu)成巨大的危害。生物降解（biodegradation）是有機(jī)物在生態(tài)環(huán)境中變化的主要機(jī)制[1]，其定義為有機(jī)化學(xué)品（污染物）在環(huán)境中的微生物酶的作用下，發(fā)生一系列的生物化學(xué)反應(yīng)（如氧化、還原、水解、脫氫、脫鹵等），使復(fù)雜的有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單的有機(jī)物或無(wú)機(jī)物（如CO2和H2O）的生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程[2]。生物降解是一個(gè)綜合的生物化學(xué)反應(yīng)，一般都分為多個(gè)步驟進(jìn)行，根據(jù)降解反應(yīng)的進(jìn)行程度不同，一般可分為初級(jí)和最終生物降解[3]。

（1）初級(jí)生物降解（Primary biodegradation）指有機(jī)化學(xué)品的分子結(jié)構(gòu)在微生物分泌的酶的作用下分子發(fā)生改變，母體分子骨架發(fā)生初級(jí)生物降解，從而導(dǎo)致其失去原有的化學(xué)性質(zhì)[4]；

（2）最終生物降解（Ultimate biodegradation）指化學(xué)品的分子結(jié)構(gòu)完全被微生物破壞，其分子作為微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的碳來(lái)源和能量來(lái)源，最終生成無(wú)機(jī)鹽、CO2和H2O（這是一個(gè)礦化的過(guò)程），即完全被微生物降解利用。

由于初級(jí)生物降解不完全，初級(jí)生物降解產(chǎn)物在一定程度可能會(huì)繼續(xù)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成危害，而最終生物降解的產(chǎn)物為能夠被環(huán)境利用或者可以轉(zhuǎn)化成有益于整個(gè)生態(tài)環(huán)境的能量[5]。因此，也有人提出更為完整的生物降解過(guò)程包含三個(gè)過(guò)程[6，7]：一是初級(jí)生物降解（母體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變導(dǎo)致理化性質(zhì)發(fā)生變化）；二是環(huán)境可接受的生物降解（降解的各級(jí)產(chǎn)物都不會(huì)污染生態(tài)環(huán)境）；三是最終生物降解（有機(jī)物完全被生物礦化）。

化學(xué)品生物降解的測(cè)定是在化學(xué)品作為微生物的唯一碳源和能量來(lái)源的條件下進(jìn)行的，包括化學(xué)品在微生物中的曝露過(guò)程和化學(xué)品因生物降解而消失過(guò)程中的定量分析[8]。

1 化學(xué)品在微生物中的曝露

研究化學(xué)品在微生物中的曝露方法時(shí)，必須考慮菌種的選擇和降解條件等主要的影響因素：

對(duì)于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中菌種的選擇，通常有三種方法：⑴使用從被測(cè)物的實(shí)際降解過(guò)程的環(huán)境中采集的微生物（包含活性微生物的活性污泥）作為實(shí)驗(yàn)用的菌種；⑵選用按實(shí)驗(yàn)規(guī)定的混合的微生物菌種進(jìn)行生物降解實(shí)驗(yàn)（混合菌種法）；⑶ 采用單一的微生物菌種作為實(shí)驗(yàn)接種的菌種（純菌種法）。但是，無(wú)論采用哪種菌種，都需要考慮馴化方法和馴化時(shí)間的問(wèn)題，并且要在曝露實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法中進(jìn)行規(guī)定，以避免不同實(shí)驗(yàn)方法帶來(lái)的不同結(jié)果。

其次還要考慮曝露實(shí)驗(yàn)是在好氧，還是厭氧條件下進(jìn)行的。曝露實(shí)驗(yàn)具體方法主要有[9]：

⑴ 河水衰減試驗(yàn)（River die way test）：模擬天然水體環(huán)境中的曝露條件。河水衰減試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室中用適量的河水與有機(jī)物混合，在室溫下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，然后測(cè)定生物降解率。該方法雖然能夠模擬有機(jī)物在自然環(huán)境下的降解過(guò)程，但是由于河水中微生物的量相對(duì)較少，使得反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，并且由于各地的河水不同，也有較大的實(shí)驗(yàn)誤差，因此實(shí)驗(yàn)室不宜采用河水衰減法進(jìn)行曝露實(shí)驗(yàn)。

⑵振蕩培養(yǎng)法（Shake flask test）：按實(shí)驗(yàn)規(guī)定的程序進(jìn)行接種、馴化菌種后，將有機(jī)物和菌種置于振蕩瓶中，將瓶置于振蕩器上在一定的溫度條件下振蕩一定時(shí)間進(jìn)行曝露實(shí)驗(yàn)（好氧條件下的曝露實(shí)驗(yàn)）。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15818-1995搖瓶試驗(yàn)法原理就是振蕩培養(yǎng)，其微生物源取處理自民用生活廢水的污水處理廠，該方法是將活性污泥和表面活性劑加入含有微生物培養(yǎng)液的介質(zhì)中，按規(guī)定方法進(jìn)行培養(yǎng)和測(cè)定樣品的濃度變化。該方法操作簡(jiǎn)單，可重現(xiàn)性也較好，其應(yīng)用比較普遍[9]。

⑶半連續(xù)活性污泥法（SCAS）或連續(xù)活性污泥法（CAS）：模擬污水處理廠中的曝露條件。連續(xù)活性污泥法是以一定量的有機(jī)化學(xué)品和含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的人工污水連續(xù)進(jìn)入含活性污泥的裝置中，測(cè)定化學(xué)品進(jìn)出口的濃度變化，得到其生物降解度[9]；半連續(xù)活性污泥法則是化學(xué)品和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)按一定的濃度逐天增加，以誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生分解化學(xué)品的生物酶（誘導(dǎo)選擇過(guò)程）。兩種實(shí)驗(yàn)方法都是使用活性污泥，模擬城市污水處理廠的生物處理過(guò)程。使用活性污泥模擬污水處理的測(cè)定方法類似實(shí)際過(guò)程，但有時(shí)間長(zhǎng)、操作條件不易控制、數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)。

⑷ 密閉瓶法（Closed bottle test）：按實(shí)驗(yàn)規(guī)定的程序接種和馴化菌種，將被測(cè)物和菌種置于密閉試驗(yàn)瓶中，靜置一定時(shí)間后進(jìn)行曝露實(shí)驗(yàn)（厭氧條件下的曝露實(shí)驗(yàn)）[9]。

2 被測(cè)物的定量分析

評(píng)價(jià)化學(xué)品的降解度的方法有很多，隨著化學(xué)品的不同，其評(píng)價(jià)方法也不同，因此需要注意各種方法本身的適用范圍以及局限性，以及不同定量評(píng)價(jià)方法所得到結(jié)果的差異性。有機(jī)物的去除率、耗氧量、最終產(chǎn)物量和微生物及其活性,都可以用于有機(jī)物的好氧生物降解性的定量分析。常用的研究化學(xué)品生物降解度的方法可以分為以下幾類：

⑴表面活性法

表面活性法通常用于測(cè)定具有表面活性的物質(zhì)，如皮革加脂劑、表面活性劑等。具體的測(cè)試方法通常包括：① 泡沫法（通過(guò)測(cè)定泡沫的高度進(jìn)行測(cè)試）；② 表面張力法(測(cè)定有機(jī)物溶液表面張力的變化)；③ 極譜法（polarography,測(cè)定其膠束濃度）。表面活性法用于測(cè)定具有表面活性的物質(zhì)的初級(jí)生物降解，雖然這是一種快速的方法，但是在一些情況下并非是有效的方法，因?yàn)楸砻婊钚缘臏y(cè)定容易受微量雜質(zhì)干擾，所以該方法只是在沒(méi)有合適的專門分析方法時(shí)才適合使用。

⑵專用化學(xué)法

根據(jù)有機(jī)化合物的不同，采用的專用分析手段也不同，如使用亞甲藍(lán)法（MBAS）測(cè)定陰離子表面活性劑的濃度變化[10]，該法具有靈敏度高、操作方便、測(cè)定快速等優(yōu)點(diǎn)，得到了較為廣泛的應(yīng)用。此外，分析含EO基團(tuán)的非離子表面活性劑的碘鉍法（BIAS）和硫氰酸鈷法（CTAS）等方法都成了定量分析的經(jīng)典方法[11]。

⑶物理化學(xué)法

常用的物理化學(xué)分析方法包括：①高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜法；②薄層色譜法（TLC）；③電泳法；④氣象色譜法；⑤放射性元素示蹤技術(shù)法；⑥光譜法；⑦電化學(xué)法；⑧其它波譜分析法如：紅外（FTIR）、紫外（UV）、核磁共振（NMR）、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）等。物理化學(xué)法是研究化學(xué)品的生物降解機(jī)理和生物降解過(guò)程的最為有力的工具。

⑷與代謝有關(guān)的非特定方法

一般認(rèn)為，最終好氧生物降解是以下式為基礎(chǔ)[12]：

測(cè)定物質(zhì)(DOC)+O2→CO2+H2O+生物量

因此，溶解有機(jī)碳（Dissolved Organic Carbon,縮寫為DOC)、生物化學(xué)需氧量 (Biochemical Oxygen Demand,縮寫為BOD)及二氧化碳排放量(CO2)、化學(xué)耗氧量（Chemical Oxygen Demand,縮寫為COD）等都可用于表征化學(xué)品的最終生物降解性[13]。

二氧化碳排放量法是在一定的時(shí)間內(nèi)測(cè)量生物降解反應(yīng)所生產(chǎn)的CO2的量來(lái)計(jì)算降解率，但是由于生物降解反應(yīng)的產(chǎn)物除了CO2外往往還有其他物質(zhì)（碳也有可能轉(zhuǎn)化成微生物的生物量），所以使用該法測(cè)定時(shí)測(cè)量結(jié)果往往都會(huì)偏低。2006年，OECD（世界經(jīng)合組織）發(fā)布了密閉瓶二氧化碳法[14]，該方法是一種能夠快速評(píng)價(jià)生物降解的測(cè)試方法，該方法除了測(cè)定降解產(chǎn)生的二氧化碳外，還使用了分析測(cè)試設(shè)備測(cè)定無(wú)機(jī)碳的生成量，從而能夠更加有效地評(píng)價(jià)生物降解，因此該分析方法得到了廣泛的使用。

BOD（生化耗氧量）指有氧的條件下，好氧微生物使化學(xué)品降解所耗費(fèi)的氧氣的量。圖1[15]為有機(jī)物的好氧生物降解和好氧微生物細(xì)胞物質(zhì)的合成示意圖，BOD即為Oa和Ob之和。生物耗氧量越高，意味著水中的易降解的化學(xué)品越多。生物耗氧量法只適用于需氧條件下的生物降解，通過(guò)測(cè)定化學(xué)品的生化耗氧量可測(cè)定一定時(shí)間化學(xué)品生物降解的程度，化學(xué)品的最終濃度可以通過(guò)測(cè)定溶解的總有機(jī)碳進(jìn)行間接測(cè)定。

圖1 有機(jī)物氧化和微生物細(xì)胞合成關(guān)系Fig.1 The relationship between the oxidation of organic compound and the synthesis of microbial cell

在BOD測(cè)試中，最常用的參數(shù)為最后一天的生物化學(xué)需氧量(BODu)與理論耗氧量(ThOD)的比值，可直接反映化學(xué)品的可生物降解程度[16]。

COD指用氧化劑（常用重鉻酸鉀）氧化化學(xué)品所耗費(fèi)的氧氣量。但重鉻酸鉀法對(duì)于測(cè)定污染程度低的水樣不適用，因此測(cè)量天然水體的COD一般采用高錳酸鉀法或耗氧量法[17]；同時(shí)，值得注意的是對(duì)于同一水樣的測(cè)定，重鉻酸鉀法一般偏高。

⑸微生物特定的生理生化指標(biāo)法

生物降解的定量分析也可以通過(guò)微生物的活性進(jìn)行檢測(cè)。微生物的活性是通過(guò)微生物細(xì)胞內(nèi)特定酶的活性（ATP、脫氫酶等）進(jìn)行反映。但是DHA一般只能反映特定的微生物種群的生物活性，而不能反映系統(tǒng)中所有微生物的活性，因此DHA法的使用受到了很大限制[18]。

⑹放射性同位素示蹤法

放射性同位素示蹤法是指用14C或其它元素的放射性的同位素合成被測(cè)化學(xué)品，在生物降解過(guò)程中通過(guò)測(cè)定中間產(chǎn)物、剩余物質(zhì)、微生物細(xì)胞內(nèi)、氣體產(chǎn)物及其它產(chǎn)物中的14C或者其它同位素，達(dá)到了解降解歷程的目的，從而在理論上分析生物降解的各個(gè)細(xì)微過(guò)程。但是當(dāng)化學(xué)品組成不明或者成分復(fù)雜時(shí)，就很難用具有放射性的同位素來(lái)合成[19]，因此該方法沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用。

總的來(lái)說(shuō)，由于生物降解實(shí)驗(yàn)的干擾因素多，不同的實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)條件可能會(huì)得到不同的降解數(shù)據(jù)和降解結(jié)果，甚至有可能無(wú)法對(duì)比不同方法得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是這些方法在一定程度能反映有機(jī)化學(xué)品在自然環(huán)境中潛在的生物降解能力，所以在很多標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的測(cè)試方法里可用上述參數(shù)表征化學(xué)品的生物降解性能[12]。

3 有機(jī)物厭氧生物降解的評(píng)價(jià)方法

在厭氧的環(huán)境中，厭氧微生物往往能夠降解好氧微生物難以降解的化學(xué)品，使用厭氧生物降解的方法具有產(chǎn)生污泥少、運(yùn)行成本低以及可以回收生物燃料等特點(diǎn)[20]。有機(jī)物的厭氧生物降解在有機(jī)廢水的處理中得到了一些應(yīng)用，并逐漸受到廣泛的關(guān)注。一般地，有機(jī)化合物的厭氧生物降解是按下式進(jìn)行：

因此評(píng)價(jià)化學(xué)品的厭氧生物降解特性可以用反應(yīng)前后有機(jī)物基質(zhì)的濃度變化、產(chǎn)生甲烷和二氧化碳的量、微生物的活性等進(jìn)行表征[21]。與好氧生物降解性評(píng)價(jià)的不同方面表現(xiàn)為：評(píng)價(jià)有機(jī)物厭氧生物降解的產(chǎn)氣量可用測(cè)定氣體體積或氣體中碳的量來(lái)進(jìn)行表征[22]。

4 其它降解方法

當(dāng)前世界污染物處理技術(shù)研究的比較活躍領(lǐng)域是利用催化氧化技術(shù)（如光、電、聲、磁等）、超臨界水氧化技術(shù)、利用新材料（如半導(dǎo)體材料）作為催化劑的光催化氧化技術(shù)、濕式氧化技術(shù)等進(jìn)行污染物處理，這些方法尤其適用于致癌、致基因突變、致畸的有機(jī)污染物[23]。其中光催化氧化技術(shù)由于在光催化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的羥基自由基的氧化性非常強(qiáng)，可以氧化大多數(shù)的有機(jī)污染物，并且氧化沒(méi)有選擇性，因此具有較大的優(yōu)勢(shì)。光催化氧化常見(jiàn)的半導(dǎo)體催化劑為TiO2，這種催化劑具有穩(wěn)定性好、抗磨損性好、對(duì)人體和環(huán)境無(wú)毒無(wú)害、價(jià)格低廉等眾多優(yōu)點(diǎn)，使得光催化氧化技術(shù)在有機(jī)物的降解方面具有廣闊的應(yīng)用前景[24,25]。與常規(guī)污水處理方法相比，濕式氧化法具有二次污染低、反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，因而受到了人們的廣泛的關(guān)注[26]。另外一個(gè)研究的熱點(diǎn)就是利用生物膜技術(shù)處理污染物，如移動(dòng)床生物膜反應(yīng)器是近年來(lái)受到廣泛關(guān)注的新型生物膜反應(yīng)器，這是結(jié)合了生物膜法和活性污泥法優(yōu)點(diǎn)于一體的新型的污水生物處理技術(shù)，該技術(shù)具有有機(jī)污染物去除率高、有一定的除磷效果的優(yōu)點(diǎn)[27]。

利用超聲波、微波等電磁波，以及復(fù)合磁場(chǎng)處理技術(shù)和電化學(xué)處理技術(shù)等也是近年發(fā)展起來(lái)的新型污水處理技術(shù)，這些技術(shù)在一定程度上能夠克服利用常規(guī)方法處理污水的不足。另外，超臨界水氧化、超臨界流體萃取、集成化膜法、天然高分子絮凝法、零價(jià)鐵還原和等離子體降解法等技術(shù)為有機(jī)污染物的處理提供了有效的途徑[27,28]。

在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中污染物的種類多種多樣，往往用常規(guī)的處理方法不能解決，這就需要分析污染物的種類有針對(duì)性地使用特定的處理技術(shù)，達(dá)到污染物降解的目的。