一例雞馬立克氏病與沙門氏菌病混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

劉奉明， 袁治祥， 溫貴蘭，3， 張?zhí)埃?覃廷玉， 田碧霞，鄧華成， 張?zhí)A， 冷玉霞， 汪德生，3*

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省思南縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 思南 565100；3. 貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

1 流行病學(xué)調(diào)查及癥狀

2019年6月28日，思南縣某養(yǎng)殖專業(yè)合作社購進(jìn)1日齡脫溫雞苗500羽，65日齡開始發(fā)病。病初出現(xiàn)瞌睡，拉黃白色糞便(呈米湯樣)，脫毛，消瘦。發(fā)病數(shù)150余只，發(fā)病率30%(150/500)，后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，至送檢時(shí)已死亡63只，病死率42%(63/150)，病程10天左右。曾用頭孢噻呋鈉、氟苯尼考、磺胺甲氧吡嗪、土霉素及白頭翁等藥物治療，但效果不好。該養(yǎng)殖場已先后進(jìn)行過新城疫、傳染性支氣管炎、雞痘、傳染性法氏囊病、禽流感疫苗免疫。

2 病理變化

對病雞進(jìn)行剖檢，可見肺部結(jié)節(jié)，小腸出血，胸部皮下有粟粒大小的黃色顆粒結(jié)節(jié)，心臟表面有白色結(jié)節(jié)。坐骨神經(jīng)未觀察到病變。

3 實(shí)驗(yàn)室檢測

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定無菌操作取病死雞肝臟劃線接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基， 37 ℃培養(yǎng)24 h觀察， 可見在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長出光滑、邊緣整齊、濕潤、微隆起、露滴狀的小菌落。挑取菌落經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性短小桿菌。取純培養(yǎng)物分別接種生化試驗(yàn)培養(yǎng)基，結(jié)果與沙門氏菌生化特性相符(見表1)。鑒定為沙門氏菌。

3.2 馬立克氏病病毒(MDV)抗原抗體檢測采集病雞羽髓8份加入適量PBS液，搗碎，凍融3次后離心，上清液作為馬立克氏病待檢抗原。采集病雞血液12份經(jīng)3 500 r/min離心，上清液作為馬立克氏病待檢血清(抗體)。分別與馬立克氏病標(biāo)準(zhǔn)血清、標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果有6份待檢抗原、5份待檢血清與馬立克氏病標(biāo)準(zhǔn)血清、標(biāo)準(zhǔn)抗原出現(xiàn)白色沉淀線，表明有MDV感染。

表1 分離菌生化試驗(yàn)

注：+為陽性反應(yīng)，-為陰性反應(yīng)

3.3 馬立克氏病病毒、禽白血病病毒(ALV)核酸檢測采集病雞肝臟和脾臟混合，按照生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)的基因組RNA快速抽提試劑盒說明書進(jìn)行總RNA的提取，按照康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)的HiFi-Script cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA。分別用ALV-A/B/J和MDV 4對特異性引物對核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總體積20 μL。反應(yīng)體系：EsTaqMix 10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上游引物(F) 1.0 μL，下游引物(R) 1.0 μL，ddH2O 6.0 μL。引物序列見表2。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。預(yù)擴(kuò)增大?。篈LV-A 715 bp，ALV-B 515 bp，ALV-J 422 bp，MDV 522 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。 2份病料中均檢測出MDV核酸；9份病料中未檢測出ALV核酸。

表2 引物序列

4 結(jié)果

通過對發(fā)病雞現(xiàn)場觀察與剖檢、實(shí)驗(yàn)室檢測到雞馬立克氏病病毒和沙門氏菌，診斷造成本次雞發(fā)病死亡的主要原因是馬立克氏病與沙門氏菌病混合感染。

5 討論

5.1雞馬立克氏病 (Marek’s disease， MD) 是雞的1種淋巴組織增生性疾病，以外周神經(jīng)、性腺、虹膜、各內(nèi)臟器官、肌肉和皮膚等單個(gè)或多個(gè)組織器官發(fā)生單核細(xì)胞浸潤為特征。該病是由細(xì)胞結(jié)合性皰疹病毒引起的傳染性腫瘤病，病雞常見消瘦、肢體麻痹，并常有急性死亡[1]。沙門氏菌常引起雞白痢，雛雞通常表現(xiàn)全身急性感染，成年雞則以局部和慢性感染為主，可造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，有的雞群死亡率可達(dá)到100%[2]。

5.2雞馬立克氏病的免疫通常在剛出殼時(shí)(1日齡)進(jìn)行，但其產(chǎn)生抗體需要一段時(shí)間(至少7日齡以上)，因此存在1個(gè)免疫空白期。在此期間一定要加強(qiáng)環(huán)境消毒，以免被野毒感染而導(dǎo)致發(fā)病。馬立克氏病是1種腫瘤消耗性疾病，無治療價(jià)值，一旦感染只能采取淘汰處理。

5.3雞馬立克氏病和禽白血病有很多相似之處，臨床上都表現(xiàn)消瘦、腫瘤，大部分雞發(fā)生馬立克氏病后期腫瘤結(jié)節(jié)都會(huì)突出實(shí)質(zhì)器官的表面，而禽白血病出現(xiàn)這種情況的概率較少，但確定性鑒別診斷還需通過實(shí)驗(yàn)室病原核酸檢測。