苦草對底泥中重金屬銅的生理響應(yīng)

潘倩羽 楊潤昭 李 俊 康彩霞

(華東交通大學(xué)土木建筑學(xué)院，江西 南昌 330013)

引言

沉水植物是水生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級生產(chǎn)力，對水體中的重金屬和氮磷都有良好的富集效果[1-4]，但近年來隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展，鄱陽湖各入湖河流收納了大量的城鎮(zhèn)生活污水和工農(nóng)業(yè)廢水，輸入了較多的營養(yǎng)鹽和重金屬物質(zhì)，導(dǎo)致了鄱陽湖水質(zhì)的惡化[5]，而過量的重金屬也會對沉水植物造成嚴重生理脅迫。目前對鄱陽湖的水質(zhì)研究主要集中在富營養(yǎng)化，調(diào)查中發(fā)現(xiàn)龍口近年來受頻繁的采砂活動影響甚嚴重，加劇了湖區(qū)的重金屬污染，在相關(guān)文獻中也提到鄱陽湖主要入湖口重金屬元素呈復(fù)合污染，其中沉積物中重金屬Cu污染程度最高[6]，而底泥中可提取態(tài)的重金屬占總量比例越高，重金屬越易釋放造成二次污染[7]。鄱陽湖區(qū)土壤中Cu含量分布差異較大，最高值為342.54mg/kg，位于蔡家灣。最低值為6.83mg/kg，位于都昌[8]。目前相關(guān)研究表明，60μM Cu2+能抑制擬南芥合成生長素的吲哚-3-丙酮酸途徑中TAA1和YUCCA家族基因的表達，從而使得根尖生長素含量減少，抑制主根生長[9]；在相同處理時間條件下，隨著銅濃度的增大，檸檬香蜂草的SOD以及葉綠素含量均表現(xiàn)低促高抑的趨勢[10]；Cu2+濃度為≤200mg/kg可促進香椿的生長，隨著Cu2+濃度的升高，可溶性蛋白含量先降低后升高而后又下降[13]。重金屬Cu是植物必需的微量元素之一，是一些酶(如多酚氧化酶、抗壞血酸氧化酶、細胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD))的成分，可以影響氧化還原過程，還存在于葉綠體的質(zhì)體藍素中，參與光合作用的電子傳遞體系，對植物的生長發(fā)育起著十分重要的作用[11]。目前研究表明，鄱陽湖濕地沉水植物以苦草為廣布種，但近年來的鄱陽湖水質(zhì)監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，各區(qū)域水質(zhì)呈下降趨勢，一定程度上導(dǎo)致了沉水植物的減少[12]。本實驗以苦草為實驗材料，著重研究其對底泥中重金屬銅的生理響應(yīng)，旨在為近年來鄱陽湖水生態(tài)系統(tǒng)沉水植物的保護提供依據(jù)，并為進一步探索沉水植物對重金屬污染的早期預(yù)警和耐性機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

苦草(Vallisneria Asiatica)冬芽于一月上旬采自鄱陽湖，帶泥培養(yǎng)在鄱陽湖星子站濕地實驗室中。存儲一段時間，待發(fā)芽后一個半月，選取長勢良好且一致的植株，用自來水沖洗干凈，染毒前一周對其馴化。底泥采自鄱陽湖星子站未受重金屬污染泥土，過2 mm孔徑篩，混合均勻備用。

1.2 實驗設(shè)置

實驗設(shè)置在潘陽湖星子站室外，將苦草水深環(huán)境設(shè)為1.5m，并設(shè)置三組平行實驗。每組底泥分別加入CuSO4·5H2O，使底泥中w(Cu)分別為50mg/kg，80mg/kg，150mg/kg，250mg/kg。為防止底泥中的重金屬進入上部覆水，在每個塑料桶底泥表面平鋪2cm細沙。每個塑料桶種6株苦草，用尼龍繩將這些塑料桶分別固定于兩個2m×2m×2m的水池。實驗從2018年6月11日開始，計為0d采樣，在第19d結(jié)束試驗并采樣。實驗期間采用自然光照，排除光照不足，病蟲害等因素對苦草生長的影響。取樣的植株洗凈后，用紙擦干植物表面水分，取每株相同部位的苦草葉片，測定葉片葉綠素a，過氧化物酶(POD)比活力，超氧化物歧化酶(SOD)，可溶性蛋白含量(SP)。

從樣品剪取苦草葉片，稱取約0.2g葉片組織，放入冰水預(yù)冷的研缽中，以液氮冷凍，加入1 mL的50 mmol·L-1PBS(磷酸緩沖鹽溶液 Phosphate buffer saline)(pH 7. 8)研磨均勻，再加入3 mL上述PBS緩沖液，倒入4 mL離心管，于4 ℃條件下12 000xg離心20 min，上清液即為粗酶提取液。

SOD活性測定采用氮藍四唑(NBT)光化還原法[13]。在3mL反應(yīng)液中含有130mmol/L甲硫氨酸、750μmol/L NBT、20μmol/L 核黃素、100 μmol/L EDTA-2Na、50mmol/L 磷酸緩沖液(pH7.5)、待測酶液(空白以緩沖溶液代替，以不對照光的管作調(diào)零)，在4000lx光下照射20min后，NBT光化還原產(chǎn)物藍色甲腙在560 nm有最大吸收，在此條件下，反應(yīng)被抑制50%所需酶量為1個活力單位。

POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法。該方法參照Tsibris[14]等人的方法，將2.3mL的10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含0.50mol/L CaCl)、0.5mL的78 mmol/L愈創(chuàng)木酚和0.1mL的待測酶液樣品充分混合，最后加入0.2mL的4.5mmol/L H2O2溶液，反應(yīng)3 min，在波長470 nm 處測定吸光度值。吸光度值每分鐘變化0.01個單位記為1U。

可溶性蛋白(SP)含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法。該方法參照王艾平，周麗明[15]的優(yōu)化方法，取待測液1.0mL，加入考馬斯亮藍G-250溶液(0.01%)4.0mL，以蒸餾水補至總體積為10.0mL，混勻，25℃條件下放置35min，于595nm處測定其吸光度。

葉綠素含量測定采用分光光度法。取1g樣品，加入10 mL純丙酮及少許CaCO3(中和酸性，防止葉綠素酯酶分解葉綠素)和石英砂，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管，用適量80%丙酮洗滌研缽，定容15ml后，取4ml(5ml，或10ml也行)離心。12000 xg離心10 min。取上清液(色素提取液)1.5 mL，加80%丙酮1.5 mL，空白為80%丙酮，測定663nm、645nm處的吸光度A663、A645。

1.3 統(tǒng)計分析方法

各指標測定結(jié)果均以平均值±標準誤差表示。使用SPSS軟件(SPSS 19.0 for Windows)對同一染毒時間各處理組與對照組之間某指標平均值進行方差分析(one-way ANOVA，LSD檢驗)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同Cu2+濃度對苦草生長影響

由表1可知，在銅離子濃度小于80mg/kg時，苦草葉片逐漸變寬，長勢逐漸良好。當銅離子為150mg/kg時新生葉片較少，顏色深綠。在銅離子為250mg/kg時植株矮小。

表1 不同銅離子濃度下苦草的生長狀況

2.2 不同Cu2+濃度對苦草葉片葉綠素含量的影響

由圖1可知，實驗過程中苦草葉片中葉綠素隨Cu2+濃度增加先出現(xiàn)上升，然后下降恢復(fù)正常穩(wěn)定值。當Cu2+濃度處于50mg/kg時葉綠素量達到最大值，隨后葉綠素量隨著Cu2+濃度的增加逐漸下降最終趨于穩(wěn)定。

圖1 不同銅離子濃度下苦草的葉綠素含量

2.3 不同Cu2+濃度對苦草葉片可溶性蛋白含量的影響

由圖2可知，苦草葉片中可溶性蛋白含量(SP)隨著Cu2+濃度的增加先增加最后逐步下降，在Cu2+濃度為80mg/kg時達到最大值，隨后可溶性蛋白含量(SP)隨著Cu2+濃度增加逐漸降低。

圖2 不同銅離子濃度下苦草的可溶性蛋白含量

2.4 不同Cu2+濃度對苦草葉片POD含量的影響

由圖3可知，隨著 Cu2+濃度增加，苦草葉片中POD含量逐漸增加，但過量Cu2+濃度又會使POD含量降低。Cu2+濃度為150mg/kg時POD含量達到最大值，隨后POD含量開始隨著Cu2+濃度的增加而下降。由此可見，低濃度Cu2+對苦草葉POD 產(chǎn)量有所提高，高濃度有所抑制。

圖3 不同銅離子濃度下苦草的POD活性

2.5 不同Cu2+濃度對苦草葉片SOD含量的影響

由圖4可知，隨著Cu2+濃度增加，SOD含量增加，當 Cu2+濃度為80mg/kg和Cu2+濃度為150mg/kg時SOD含量達到最大值并基本保持不變，隨后在Cu2+濃度為250mg/kg時SOD含量下降。由此可見，低濃度Cu2+對苦草葉SOD 產(chǎn)量有所提高，高濃度有所抑制。

圖4 不同銅離子濃度下苦草的SOD活性

3 討論

Cu是植物有機體必需的一種金屬元素，微量的Cu對生物體有積極作用，如Cu存在于葉綠體的質(zhì)體藍素中，參與光合作用的電子傳遞體系，對植物的生長發(fā)育起著十分重要的作用，并且作為SOD的重要輔基，Cu對清除氧自由基以保護細胞有重要作用[16]，可見，低濃度Cu2+有助于植物的生長。從實驗分析來看，在低濃度Cu2+環(huán)境下，Cu2+參與光合作用電子傳遞體系[16]，苦草的生長可以得到促進。在本實驗中，SOD和POD的活性出現(xiàn)一定程度的升高，這是植物體的保護性反應(yīng)，能有效地清除毒害所產(chǎn)生的活性氧。但抗氧化能力有限，一旦Cu2+濃度過高，活性氧的動態(tài)平衡被打破，產(chǎn)生了大量剩余活性氧，則其對苦草就會造成氧化損傷，苦草光合作用功能下降[17]，葉綠素、可溶性蛋白含量較對照組含量而言都有所下降，這說明高濃度Cu2+會對苦草產(chǎn)生脅迫，影響苦草生長。

3.1 苦草的代謝反應(yīng)

經(jīng)過19d處理后，苦草內(nèi)葉綠素含量有小幅度上升，表明低濃度Cu2+可促進苦草生理代謝。但當Cu2+濃度處于較高階段，葉綠素含量驟然下降，且與對照組葉綠素含量相比，有所下降。銅是一些金屬蛋白酶(例如：SOD、POD)的結(jié)構(gòu)元素，其參與植物重要的生物過程，如光合作用、呼吸、氧化超氧化物清除等，但過量的銅會導(dǎo)致植物生物量減少、生長發(fā)育遲緩，甚至引起萎黃病和壞死[18]。實驗結(jié)果表明高濃度Cu2+會抑制苦草新陳代謝。光合作用是植物體內(nèi)較為重要的代謝過程，其強弱對植物生長及抗逆性具有十分重要的影響，并且葉綠素的高低在很大程度上反映了植物的生長狀況和光合作用效率[19]。銅作為植物生命活動的微量元素，當其濃度較低時能夠促進光合作用，反之則抑制。過量的銅會改變?nèi)~綠體或類囊體的結(jié)構(gòu)，甚至?xí)?dǎo)致植物生物量減小，細痩萎黃，銅和D1蛋白的絡(luò)氨酸殘基相結(jié)合，可抑制光系統(tǒng)II(PSⅡ)的電子傳遞[20]，或?qū)е录毎豣559氧化還原端的改變[21]，光合作用所儲存的能量減少，光合電子傳遞降低，導(dǎo)致生物量減少[22]，銅脅迫使葉綠素含量大幅下降，24 h內(nèi)使初始熒光(Fo)和最大熒光(Fm)升高，特別是Fm可能出現(xiàn)負值，表明光合器官己受到破壞[23]，致使光合作用效率降低、葉綠素含量下降。植物新陳代謝所涉及到的酶大多屬于蛋白質(zhì)，而本實驗所測的可溶性蛋白含量在低濃度Cu2+環(huán)境下會有一定幅度的上升，但隨著Cu2+濃度處于較高階段時，植物體內(nèi)可溶性蛋白含量逐步下降，說明在高濃度Cu2+環(huán)境，苦草受到了重金屬脅迫。

3.2 苦草的抗氧化反應(yīng)

銅是一種具有氧化還原性的金屬，Cu2+過量后表現(xiàn)為高毒性，會對植物體產(chǎn)生氧化脅迫，形成有害的活性氧(ROS)，破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，同時催化芬頓(Fenton)反應(yīng)生成羥基自由基，導(dǎo)致脂類、蛋白質(zhì)和DNA損害[24]，導(dǎo)致植物出現(xiàn)生物量減少、根系生長受抑制及萎黃病、燙傷、壞死等癥狀[25]。但植物可通過過酶和非酶抗氧化系統(tǒng)保護其自身免受氧化損傷，其中用于清除ROS的酶包括SOD和POD等，它們分布在植物細胞的不同位點上，相互協(xié)作清除體內(nèi)ROS[9]。本實驗中銅處理后苦草中SOD含量以及POD含量隨著Cu2+濃度的增加不斷上升，但當Cu2+濃度處于250 mg/kg時二者含量下降。該情況說明，在脅迫條件下時，植物體ROS的產(chǎn)生和清除平衡遭到破壞，加速了ROS的積累，進而影響植物正常的生長發(fā)育。植物通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的抗氧化物酶系抵抗Cu2+脅迫，當Cu2+濃度超過植物耐銅閾值時，其抗氧化物酶系被破壞。

4 結(jié)論

通過上述分析得出，在高濃度Cu2+環(huán)境，苦草會受到重金屬脅迫，但其可提高SOD、POD等活性來抵御脅迫。同時苦草SOD含量受Cu2+濃度影響較為明顯，在Cu2+濃度升高的每一個階層，SOD含量的增幅較大。因此，相較于一般沉水植物脅迫研究中，選用SPD比活性指標來衡量植物脅迫程度更具時效性，可作為進一步探索沉水植物對重金屬污染的早期預(yù)警。但當Cu2+濃度超過植物耐銅閾值時，其抗氧化物酶系被破壞，對苦草生長產(chǎn)生一定損傷。因此，在工農(nóng)業(yè)經(jīng)濟不斷發(fā)展的同時，合理回收利用重金屬對鄱陽湖生態(tài)系統(tǒng)的保護具有重要意義。