MDCK細胞的長鏈非編碼RNA的驗證及靶基因預測

賀 丹，敖慧娟，楊 迪，王家敏，柏家林

（1.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心 甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學實驗教學部，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；4.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，常引起不同程度的流行，包括世界性大流行、局部暴發(fā)和散發(fā)。禽流感是由甲型流感病毒亞型引起的一種急性傳染病，也可感染人類。人類感染禽流感的死亡率通常為33%[1-3]。到目前為止，由于還沒有找到治療流感和禽流感的理想藥物，接種疫苗仍然是預防流感疾病發(fā)生和流行的最有效方法[4]。Madin-Darby犬腎細胞（MDCK細胞）是由Madin和Darby于1958年建立的，來源于一只可卡犬的腎組織。由于其感染效率高、增殖快、無突變等特點，被認為是三種適合流感病毒復制的細胞系之一[5，6]。目前，由MDCK細胞生產(chǎn)的幾種流感疫苗已獲得國際認可。用MDCK細胞作為病毒復制的底物在流感疫苗生產(chǎn)中仍有爭議，因為它具有成瘤性[7，8]。實驗表明，皮下或肌肉接種腫瘤細胞系可引起裸鼠腫瘤，如果流感疫苗是從腫瘤細胞系中衍生出來的，癌基因會隨著接種而整合到人體內(nèi)，從而對人體健康構(gòu)成潛在威脅。目前，非腫瘤性MDCK細胞系的建立仍是各國疫苗研究的重點[9]。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是指一類長度大于200個核苷酸且不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA。越來越多的研究表明，高達90%的非編碼蛋白在人類基因組中也扮演著更重要的角色，而不是所謂的“轉(zhuǎn)錄噪音”。根據(jù)lncRNA相對于蛋白質(zhì)編碼基因的位置，將其分為五類：基因間lncRNA、雙向lncRNA、內(nèi)含子lncRNA、反義lncRNA和增強子lncRNA。不同類型的lncRNA可能具有不同的生物學功能。對長非編碼RNA的功能研究表明，它在表觀遺傳學、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用，從而影響了多種生物學過程[10]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的功能性lncRNA被發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)lncRNA通過調(diào)控抑癌基因影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，進一步的研究揭示了lncRNA在腫瘤中的作用機制[10，11]。隨著對lncRNA研究的深入，可以不斷揭示腫瘤的相關(guān)特征和機制，為尋找新的治療靶點提供方向。本研究基于第二代高通量測序技術(shù)對高成瘤性MDCK母細胞系和兩株低成瘤性單克隆細胞系中l(wèi)ncRNA的特性進行的測序，隨機驗證6個lncRNA，并對高/低成瘤性的MDCK細胞的lncRNA的靶基因進行了預測，為建立成瘤性更低的細胞株提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 總RNA抽提

收取MDCK-W73、MDCK-C35以及MDCK-C09細胞（6孔板80%細胞密度），放在1.5ml新的無RNase 的離心管中，加入Trizol 500μl, 置于冰上5 min，細胞得到充分裂解。為去除沉淀，4℃ 12 000 g，離心5 min；每管加入氯仿200μl，振蕩混勻，冰上靜置15 min。4℃ 12 000 g，離心15 min，小心吸取上清200μl，加入到新的1.5 ml預冷的無RNase離心管中。在新的1.5 ml離心管中加入等體積預冷的異丙醇，振蕩混勻后冰上放置10 min；4℃ 12 000 g，離心10 min后棄上清，保留沉淀。加入用DEPC水新鮮配制500 ml 75%乙醇，將沉淀輕輕重懸；離心5 min，4℃ 8 000 g，去除大部分上清液，保留沉淀；室溫放置5 min，使殘留液體揮發(fā)。待RNA沉淀基本透明時，加入無DNase/RNase ddH2O（加入體積視RNA沉淀量而定）至完全溶解，-80℃保存?zhèn)溆?。利用NanoDrop2 000對所抽提RNA濃度和純度進行檢測。將樣品在冰上融化后，充分混勻并離心，取適量樣品進行RNA完整度RIN值的檢測，檢測儀器使用Agilent2 100。一份用于測序分析，一份保留進行l(wèi)ncRNA的驗證分析。

1.2 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA

細胞總RNA中去除DNA的反應，按表1的體系和操作流程，去除DNA。室溫放置5 min，保存于4℃中。在冰上進行反應體系，混勻，短暫離心；反應溫度及程序設置：25℃反應5 min，42℃水浴反應1h，70℃水浴15 min（使RT酶失活），將得到的RT產(chǎn)物cDNA置于-20℃保存。

表1 試劑及反應體系

1.3 實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測成瘤相關(guān)基因表達

收取細胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后，使用實時熒光PCR儀進行檢測。按照All-in-one SYBR Green 實時熒光定量PCR試劑盒操作說明書對反應體系進行配置。測序報告中隨機挑選6個顯著差異表達lncRNA進行引物設計，引物序列如表2所示。利用β-actin作為內(nèi)參基因進行不同基因相對表達量的分析。反應程序為：95℃預變性10 s，95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸15 s，共四十個循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用相對定量分析F=2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；-ΔΔCt=NC組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值；2-ΔΔCt反映各樣品相對NC組樣品目的基因的相對表達水平。

1.5 lncRNA的靶基因預測

lncRNA靶基因預測是基于lncRNA與靶基因不同作用方式，可以將其預測分為順式（cis）和反式（trans）兩部分。對于樣本數(shù)少于6的樣本，采用cis作用來預測lncRNA的靶基因。Cis作用是lncRNA的一種靶基因作用方式。利用基因組注釋和基因組瀏覽器鑒定lncRNA的可能的靶基因。一般是指lncRNA上下游100 kb范圍內(nèi)的基因。啟動子區(qū)域同向轉(zhuǎn)錄的靶基因一般是促進表達作用，反向為抑制。而在3’-UTR區(qū)域時，部分情況下反向也為促進表達。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取與質(zhì)檢結(jié)果

使用NanoDrop2 000分析測定所抽提RNA濃度純度，使用瓊脂糖凝膠電泳測定抽提RNA的完整性。從表3所列實驗結(jié)果看出，所有樣本的OD260/280均分布于2.01～2.08之間，OD260/230均分布于2.05～2.13之間，提示提取的RNA純度高。

使用Agilent2100進行RIN值的檢測。圖1每個峰的集中度，代表樣品中RNA完整度，峰越集中代表樣品RNA降解率越低；RIN值表示RNA樣品的完整度，數(shù)值在1～10，數(shù)值越高代表RNA完整度越好。

表2 引物序列信息

表3 RNA純度檢測結(jié)果

圖1 Agilent測定抽提RNA的完整度

圖2 lncRNA的qRT-PCR的相對表達量和lncRNA-seq測序（FPKM）數(shù)據(jù)對比

2.2 qRT-PCR與高通量測序（lncRNA-Seq）的數(shù)據(jù)對比

在MDCK-W73、MDCK-C09和MDCK-C35中，各lncRNA的相對表達量如圖2所示。試驗結(jié)果顯示，lncRNA在各組中均有表達，與lncRNA-Seq進行對比可以發(fā)現(xiàn)，qRT-PCR與lncRNA-Seq的差異性表達相一致。由此說明，lncRNA-Seq測序結(jié)果真實可靠，為后續(xù)的試驗的開展奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.3 lncRNA靶基因預測

Cis作用是lncRNA的一種靶基因作用方式。利用基因組注釋和基因組瀏覽器鑒定

lncRNA的可能的靶基因。一般是指lncRNA上下游100kb范圍內(nèi)的基因。Cis預測結(jié)果可以表述lncRNA的id、lncRNA靶基因的id、lncRNA所在染色體、lncRNA所在鏈、靶基因位置（上游或是下游）以及靶基因離lncRNA的距離。根據(jù)lncRNA-Seq結(jié)果共獲得63個cis作用靶基因，表4所列為部分lncRNA靶基因的預測結(jié)果。

3 討論

大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄組研究分析已經(jīng)獲得了各種各樣的非編碼RNA的產(chǎn)物。非編碼RNA是所有不編碼蛋白質(zhì)功能RNA的統(tǒng)稱。長度超過200個核苷酸的哺乳動物和植物的非編碼RNA被稱為長鏈非編碼RNA（lncRNA）。H19是發(fā)現(xiàn)的第一個特異性來源于母系的lncRNA。lncRNA H19在人類胚胎中高度表達出生后，上調(diào)H19可通過調(diào)節(jié)ID2基因[12]的表達誘導膀胱癌細胞增殖。MEG3是第一個被證實對腫瘤有抑制作用的lncRNA。lncRNA-MEG3的表達受表觀遺傳學控制在許多癌癥類型中，MEG3是CPG甲基化異常，通過激活p53[13，14]調(diào)節(jié)癌細胞凋亡。目前的研究表明PCA3、PCGEM1和PCAT1是前列腺癌中高表達的lncRNA，可作為有效的生物標記物[15]。對于lncRNA的研究，熒光定量PCR技術(shù)比較普遍，實驗方法也較為成熟。但是在研究的過程中由于lncRNA的結(jié)構(gòu)比較復雜，在引物設計過程中要考慮lncRNA存在序列重疊區(qū)，應避免以此部分設計引物。lncRNA反轉(zhuǎn)錄引物設計是根據(jù)lncRNA序列的3’端設計出的配對引物，β-actin作為內(nèi)參基因。試驗根據(jù)擴增后的溶解曲線來分析反應的特異性，作為鑒別的依據(jù)。采用2-ΔΔCt數(shù)據(jù)分析方法對每個基因的三次重復數(shù)據(jù)進行相對表達量分析，并與lncRNA的測序結(jié)果進行比對。

表4 lncRNA靶基因預測的結(jié)果（部分）

lncRNA是通過調(diào)控鄰近發(fā)揮生物學功能，因此通過鄰近基因的分析可以為后續(xù)lncRNA的功能研究提供線索。Cis作用預測靶基因的意義在于，對于感興趣的差異表達lncRNAs，搜索其上下游100K范圍內(nèi)的所有編碼基因，并與該lncRNAs 有顯著共表達的基因取交集。這些在基因組上臨近、且表達模式上共表達的基因很可能被該lncRNAs 所調(diào)控。而trans作用預測靶基因是計算lncRNAs 共表達的編碼基因，集合與轉(zhuǎn)錄因子/染色質(zhì)調(diào)控復合物的靶基因集合的交集，利用超幾何分布計算該交集的富集程度，得到與lncRNAs 顯著相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，從而識別可能與lncRNAs 聯(lián)合發(fā)揮調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子/染色質(zhì)調(diào)控因子[16]。

lncRNA的組織特異性及特定的細胞定位，顯示lncRNA受到高度嚴謹?shù)恼{(diào)控，目前已知其與發(fā)育、干細胞維持、癌癥及一些疾病相關(guān)。隨著近年來隨著基因芯片及第二代高通量測序技術(shù)的廣泛運用，lncRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，其作用機制也會不斷被人類所知。