重金屬銅耐受突變株的高效構建方法

傅科鶴，范莉莉，李園園，熊國勇

(南昌師范學院生物系，330032，南昌)

0 引言

近幾十年來，隨著工業(yè)廢水排放及農藥的大量使用，導致土壤中銅的污染日趨嚴重，治理土壤銅污染成為普遍關注的一個問題[1-2]。傳統(tǒng)的治理方法如沉淀法、離子交換法、電化學法、膜分離技術等方法成本高、選擇性低、周期長，并可能產生二次污染。生物吸附能夠很好地克服上述難題而受到廣泛關注[3]。微生物由于分布廣、生長迅速、抗逆性強等優(yōu)點，在修復土壤重金屬方面具有明顯優(yōu)勢[4]。木霉菌是一種傳統(tǒng)的生防菌，具有促進植物生長、抑制土壤病原菌、分布廣泛，抗性強等特點，在生物修復方面被廣泛使用[5]。

為獲得高效修復土壤重金屬污染的木霉菌，首先要篩選高耐受菌株。只有高耐受菌株才能夠在污染土壤中繁殖，從而達到修復土壤污染的目的[6]。相比傳統(tǒng)方法，ATMT技術能夠更高效獲得高耐受突變株，所獲突變株不僅能夠直接應用于土壤銅污染的修復，同時還能為挖掘木霉菌吸附和代謝銅相關基因資源，揭示木霉菌-銅互作分子機理提供重要工具。農桿菌介導的轉化技術(ATMT)由于操作簡便、外源DNA結構完整、轉化機理清楚、整合位點穩(wěn)定、拷貝數(shù)低及對目標基因組影響小等優(yōu)點，已成為一種廣泛應用的基因轉化方法。自從1998年de Groot首次將其應用于絲狀真菌的研究后[7]，已經(jīng)有50多種絲狀真菌成功通過ATMT轉化。常規(guī)ATMT轉化過程主要包括含目標質粒的農桿菌培養(yǎng)，與目標菌孢子共培養(yǎng)及抗性平板篩選。整個過程周期長，成本高(篩選過程用到的抗生素)。因此本研究通過改進轉化過程中的抗性平板篩選步驟，使轉化及篩選效率得到明顯提高。建立一種高效突變株構建方法，能有效提高土壤重金屬修復過程中菌株獲得效率；同時，該方法有利于功能基因的克隆及分析，為構建高吸附銅工程菌株提供關鍵技術。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 農桿菌AGL1及質粒PC1300th由本實驗改造并保存，里氏木霉菌株QM9414由浙江大學農學院章初龍副教授饋贈。

1.1.2 試劑 氨芐青霉素、鏈霉素、卡那霉素、頭孢霉素購自Amresco公司，分別配成100 mg/mL，0.45 μm濾膜無菌過濾，分裝成小管，-20℃凍存?zhèn)溆?；利福平用DMSO溶解后，配制成100 mg/mL，分裝成小管，-20℃凍存?zhèn)溆茫籆u2+由CuSO4溶解于蒸餾水中，配成10 mM母液，過濾除菌備用。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 000 mL；查氏培養(yǎng)基：NaNO33.0 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g， FeSO40.01 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 ATMT突變株構建載體改造 以pCAMBIA1300質粒為骨架，將其中的35S啟動子換成適于真菌表達的Trpc啟動子。pCAMBIA1300質粒用Xhol/EcoR1雙酶切后，膠回收后得到切除了35S啟動子及hph ORF的質粒pC1300-h。然后，以1003質粒為模板，TrphU/TrphL引物擴增含有Trpc啟動子及hph ORF的1345 bp片段，片段兩端加上Xhol/EcoR1酶切位點，膠回收片段后雙酶切，與pC1300-h連接得到ATMT突變株構建載體pC1300th(圖1)。具體構建方法參見Fu et al (2010)[8]。

(a)原始質粒；(b)改造后的質粒

1.2.2 ATMT轉化方法改進 將含有質粒pC1300th的農桿菌菌株AGL1在LB平板上(含50 μg/mL的利福平與卡那霉素)劃線活化48 h，然后挑單菌落轉到20 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL利福平和鏈霉素)28℃、220 rpm振蕩培養(yǎng)30 h；用5 mL IM培養(yǎng)基將生長4 d的木霉孢子沖洗后3層擦鏡紙過濾，顯微鏡計數(shù)，用40 mL IM培養(yǎng)基稀釋到終濃度1×106cfu/mL，28℃萌發(fā)6 h；測定農桿菌OD600，確定濃度；然后按量加入到100 mL IM培養(yǎng)基，終濃度達到OD600=0.3；28℃、240 rpm振蕩培養(yǎng)6 h，測定OD，達到0.6即可；將農桿菌與木霉孢子液等量混勻后，按每平皿200 μL涂IM平板，靜置30 min待水分吸干后，22℃共培養(yǎng)48 h；將玻璃紙轉移到含高濃度銅篩選培養(yǎng)基(對野生菌株致死)篩選。培養(yǎng)時間不超過5 d。挑選疑似的轉化子到CY培養(yǎng)基(含250 μg/mL特美汀及200 μg/mL潮霉素)，然后再用CY培養(yǎng)基(含250 μg/mL特美汀)傳5代后，單孢分離后轉接到含潮霉素的平板驗證；提取突變子的基因組DNA，PCR驗證。與傳統(tǒng)的方法相比，改進方法主要是在最后一步轉膜過程中，將共培養(yǎng)后的菌連同膜一起轉移到含有高于野生株致死濃度的銅培養(yǎng)基上，將未轉化的野生株及轉化后但銅耐受性未提高的轉化子全部殺死，最后能夠生長的即為耐銅的轉化子，原理見圖2。

圖2 ATMT方法改進示意圖

1.2.3 DNA提取及PCR驗證 DNA提取按照常規(guī)的CTAB法提取，-20℃凍存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^PCR驗證目標菌株中是否含有T-DNA序列，引物序列為：

fhphU:TGTCCTGCGGGTAAATAGC

fhphL:TTGTTGGAGCCGAAATCC

用于擴增載體中的選擇標記基因潮霉素，產物為468 bp。

1.2.4 Southern blot 通過Southern blot驗證T-DNA插入拷貝數(shù)。樣品基因組DNA分別用限制性內切酶酶切后經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，80 V電泳2.5 h。將泡好的膠放入托盤，先把Marker所在的泳道切下，放入EB染液中染色；同時，將樣品膠放入到足量的脫嘌呤液，緩慢振蕩15 min，觀察膠上的溴酚藍變成黃色后，倒掉脫嘌呤液，無菌水清洗；加入足量的變性液，緩慢振蕩30 min，棄溶液，無菌水清洗3遍，再加入變性液重復處理1次；加入足量中和液緩按上述方法進行中和。同時，切和凝膠同樣長寬的尼龍膜和3張3 M濾紙，放入10×SSC溶液中潤濕。將2張17 cm的大濾紙交叉疊放在搭建的轉膜玻璃板上，將處理好的膠倒置放在上面，將潤濕的3層濾紙緊貼膠面上，轉膜24 h。轉膜結束后，取下吸水紙和濾紙，將凝膠和尼龍膜一起翻轉。將膜從膠上剝離，放入2×SSC溶液中漂洗5 min，取出平放在濾紙上，室溫晾30 min。將晾干的膜放在2張濾紙間，在烘箱80℃烘烤2 h后，錫紙包裹好保存?zhèn)溆?。探針標記和雜交采用Gene Images Alkphos Direct Labeling and Detection System Kit (Amersham)，操作根據(jù)說明書進行。預雜交至少1 h，加探針雜交16 h，洗膜、封膜后，進行X光拍照。

2 結果與分析

2.1 銅對野生株致死濃度測定

野生株活化后，打孔器取菌餅(0.5 mm直徑)轉接到含不同濃度Cu2+的PDA、YPDA及CYA培養(yǎng)基平板上，每12 h測量一次菌落直徑，計算銅對里氏木霉的致死濃度。結果表明(圖3)，當銅離子濃度達到2.0 mM時，里氏木霉不能在CYA培養(yǎng)基上生長，而在PDA及YPDA培養(yǎng)基上仍能生長；當銅離子濃度達到2.4 mM時，在PDA培養(yǎng)基上不能生長。而在YPDA培養(yǎng)基上，銅離子濃度達到3.6 mM時，才能完全抑制菌體生長。

(a)PDA培養(yǎng)基

(b)YPDA培養(yǎng)基

(c)CYA培養(yǎng)基

2.2 耐銅突變株構建

2.2.1 最佳銅離子濃度的確定 由于CYA培養(yǎng)基主要成份是無機鹽，成分明確，實驗重復性好，所以選用該培養(yǎng)基。為確定最佳的銅離子濃度(過高無法獲得突變株，過低假陽性多)，設置5個濃度：2.2 mM、2.5 mM、2.8 mM、3.1 mM、3.3 mM。以常規(guī)潮霉素平板篩選為對照，每個處理轉化20個平板(直徑9 cm)，實驗結果如表1。最佳的銅離子濃度為2.5 mM，此時，陽性率接近50%，而且獲得的總假定突變株也比較合適，平均0.45個/平板。因此，選擇該濃度為最佳銅離子濃度，用于大量構建并篩選高耐受銅的隨機突變株。

表1 改進的ATMT方法與常規(guī)方法比較

2.2.2 耐受銅突變株的構建篩選 使用上述條件共轉化320個平板，通過5代繼代培養(yǎng)及單孢分離，獲得純化的突變株。以潮霉素為引物通過PCR擴增表明，14個突變株具有468 bp的陽性條，說明初步篩選獲得了14個可能的突變株(圖4(a))。為了進一步驗證突變株，通過Southern blot對5個耐受性最強的突變株T-DNA拷貝數(shù)進一步驗證。結果表明，5個突變株中有3個突變株含有2個，拷貝數(shù)，2個突變株為單拷貝(圖4(b))。

(a)PCR驗證；(b)5個突變株用HindIII酶切后Southern blot驗證

圖4 突變株的驗證

3 結論與討論

3.1 改進前后方法比較

常規(guī)的農桿菌介導轉化(ATMT)突變株構建方法主要包含兩部分：共培養(yǎng)與篩選。按照常規(guī)的方法，大量篩選突變株將是一個費時費力的工作，如突變株的繼代培養(yǎng)，單孢分離，然后再測定銅的吸附能力等。而通過改進的方法后，獲得的突變株數(shù)量大大減少，而且得到的突變株全部是高耐受突變株，從中篩選高吸附突變株概率明顯增大。

與傳統(tǒng)方法相比，改進的ATMT方法有兩大優(yōu)勢。

3.1.1 減少了篩選的工作量 從表2可知，按照常規(guī)方法，20個平板共獲得171可能的突變株；而改進后，僅獲得11個可能的突變株，僅相當于前者的6.4%，所以大大節(jié)省了后續(xù)的篩選工作。當大量構建突變株時(突變株達到上萬時)，這種優(yōu)勢更明顯。另外，改進的方法獲得直接用高濃度銅來篩選，因此，獲得高耐受銅的突變株概率要比常規(guī)方法高。

3.1.2 減少材料損耗 共培養(yǎng)后，常規(guī)的方法通過使用抗生素(潮霉素與頭孢霉素)來篩選突變株，而改進的方法只用含銅的培養(yǎng)基篩選，大大節(jié)省了抗生素的使用，減少了費用及抗生素對環(huán)境造成的污染。以構建1萬株突變株(里氏木霉有9 000左右的蛋白，按1倍覆蓋量計算)為例，常規(guī)方法平均每皿(直徑9 cm)獲得5.2個真正的突變株(按表2 CK數(shù)據(jù)計算)，1萬突變株需要篩選1923皿，使用潮霉素與頭孢分別為30 g與60 g，而且傳代過程需要使用大量的培養(yǎng)基；而用改進的方法，在初篩選過程無需使用抗生素。

表2 ATMT方法優(yōu)化前后的比較

注：潮霉素用量：0.2 g/L；頭孢霉素用量：0.25 g/L；每L培養(yǎng)基倒60個平板(直徑9 cm)。

3.2 改進方法使用過程注意事項

對突變株構建過程中的篩選步驟進行改進，用含高濃度銅的培養(yǎng)基直接篩選可能的轉化子，通過一系列實驗后優(yōu)化出一種快速構建高耐受銅突變株方法。應用過程中需注意以下幾個方面。

1)木霉分生孢子生長。28℃倒置培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)皿不能用palm膜封口，以免影響通氣而影響孢子質量。

2)農桿菌生長。農桿菌用IM培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)時，起始OD值0.3左右，培養(yǎng)5 h后，測定OD值，如果OD值未達到0.6，可以離心濃縮。

3)共培養(yǎng)。共培養(yǎng)溫度23℃，時間48 h，過長時間產生假陽性太多。

4)覆蓋篩選。培養(yǎng)基溫度保持在50℃左右，以免燙死菌體。

在培養(yǎng)基中添加高濃度的銅離子(高于致死濃度)用于殺死未成功轉化的菌株，同時也可以殺死非耐受的突變株，因此獲得高耐受突變株的效率明顯提升。同時研究表明，與某些金屬離子如鋅等不同，銅離子的對細胞毒性是不可逆的，如WT在CY培養(yǎng)基上銅離子的致死濃度是2.0 mM，在該濃度下，培養(yǎng)時間延長菌體也未見生長，因此，用含高濃度銅離子的培養(yǎng)直接覆蓋不會誘導菌體的抗性而產生假陽性轉化子。

通過該方法共獲得15個高耐受銅突變株，銅吸附能力測定表明，其中一個突變株AT01銅吸附能力最高，每克菌絲吸附銅達到了12.73 mg，而WT僅為5.97 mg。吸附的最佳培養(yǎng)基初始pH值為5.0，培養(yǎng)最適溫度為28℃。同時，研究表明，大量吸附銅離子后，木霉的菌絲顏色明顯加深，這可以作為大量初篩選一個篩選指標，節(jié)省篩選周期。