大豆肽改善阿爾茨海默病小鼠學習記憶行為的抗氧化應激和抗凋亡機制

劉衛(wèi)云 程志國 徐宛玲 崔明辰 徐松濤 李盤欣 金少舉 馬永超,

(1承德護理職業(yè)學院，河北 承德 067000；2河北省灤平縣小營鄉(xiāng)衛(wèi)生院；3漯河醫(yī)學高等?？茖W校生物化學教研室 河南省腫瘤發(fā)生與防治創(chuàng)新型科技團隊；4河南省南街村(集團)有限公司)

阿爾茨海默病(AD)又稱“老年癡呆”，是一種以記憶障礙、認知功能損傷為特征，甚至出現(xiàn)行為怪異、人格異常等病理表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病〔1〕。AD發(fā)病機制及病理過程復雜，研究報道，海馬神經(jīng)元細胞凋亡和過氧化應激是其發(fā)病的重要原因，因此，阻滯或干預神經(jīng)元凋亡或過氧化應激是防治AD的主要策略之一〔2～4〕。大豆肽(SP)是大豆經(jīng)酶解或微生物發(fā)酵而得，一般由2～10個氨基酸組成的小分子肽，容易消化吸收，含有人體所需的多種必需氨基酸，是中老年人、腫瘤患者及胃腸功能不佳者等的常用營養(yǎng)補品〔5〕。此外，SP還具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、增強體力、緩解疲勞、降血脂及抗腫瘤等生理、藥理活性，但國內(nèi)外尚無SP防治AD的研究報道〔6～9〕。本研究通過小鼠側(cè)腦室注射β-淀粉樣蛋白(Aβ)25～35法建立AD動物模型，并給予不同劑量的SP進行干預，觀察其對AD小鼠學習記憶能力、海馬神經(jīng)元凋亡及氧化應激的影響，同時檢測海馬組織細胞色素(Cyt)C、Caspase-3、B細胞淋巴瘤(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)等凋亡相關因子的表達水平，探討SP防治AD的抗氧化應激和凋亡分子機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 SP由河南省南街村(集團)有限公司提供；鹽酸多奈哌齊(批號：20170531)， 5 mg/片，國藥準字H20070181，購自衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司；Aβ25～35，5 mg/支，批號17-03-16，購自北京博奧森生物技術有限公司(使用方法：將2 mg Aβ25～35用生理鹽水溶解為1 mg/ml濃度的儲備液，用0.22 μmol/L濾膜過濾除菌后置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育7 d，使之老化為纖絲狀凝聚態(tài)備用)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；Tunel細胞凋亡檢測試劑盒、Beyozol(總RNA抽提試劑)、BeyoRTTMIII cDNA合成試劑盒、Easy-LoadTMPCR Master Mix(2×)、DNA Molecular Weight Marker、瓊脂糖、放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、彩色預染蛋白質(zhì)分子量標準、超敏電化學發(fā)光顯色液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)快速配制試劑盒購自由碧云天生物技術有限公司提供；兔抗CytC、Caspase-3、Bax、Bcl-2及β-actin抗體、羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；PCR實驗引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計與合成。 WMT-100 Morris水迷宮分析系統(tǒng)購自成都泰盟軟件有限公司；752N型紫外可見分光光度計購自上海光學儀器廠；FA2104B電子分析天平購自上海精密儀器儀表有限公司；H2500R臺式高速冷凍離心機購自長沙湘儀離心機儀器有限公司；BX43顯微鏡購自奧林巴斯(中國)有限公司；PCR儀、垂直電泳槽、水平電泳槽、化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)等購自美國Bio-Rad公司。

1.2動物及分組 SPF級健康ICR小鼠，4周齡，18～22 g，雌雄兼用，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCCK(京)2016-0006。將小鼠分籠飼養(yǎng)于動物室，每籠10只，室溫(22±2)℃，濕度50%～60%，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。實驗分組前，小鼠進行7 d的水迷宮游泳訓練，第7天進行篩選，對找到平臺潛伏期大于60 s和游泳水平較差的小鼠予以剔除。將篩選合格的60只小鼠隨機分為陰性對照組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、陽性藥對照組(多奈哌齊 5 mg/kg)及SP 600、300及150 mg/kg劑量組，每組10只。各組先預防性灌胃(0.1 ml/10 g體重)給予相應的藥物，每天1次，持續(xù)7 d。第8天，除陰性對照組側(cè)腦室注射無菌生理鹽水10 μl，其他各組均側(cè)腦室注射老化的Aβ 25～35溶液10 μl復制AD動物模型，然后再繼續(xù)給藥14 d。

1.3Morris水迷宮實驗測試定位航行逃避潛伏期及空間探索能力 給藥結束前4 d，用Morris水迷宮實驗測試定位航行逃避潛伏期(1次/d，共4 d)及空間探索能力(最后1 d測)。具體操作方法如下，(1)定位航行試驗：將水迷宮圓形水池(直徑120 cm，高度60 cm)注入蒸餾水，控制水深12 cm，用白色素將水染白至不透明，設置水溫恒定于23～25℃。將圓形水池均分為4個象限，每象限邊緣中心即為入水點，將一圓形跳臺(直徑6 cm，高度10 cm)置于第4象限中心位置，將小鼠從4個入水點面向池壁放入水池中，記錄60 s內(nèi)找到跳臺的時間，即為定位航行逃避潛伏期，若超過60 s未能找到跳臺，則記錄逃避潛伏期為60 s，同時人為將小鼠放在平臺上停留休息30 s。(2)空間探索能力檢測實驗：定位航行實驗結束后，移除隱藏在水中的平臺，任選一入水點將小鼠放入水池中，記錄其60 s內(nèi)穿越原跳臺位置的次數(shù)及原跳臺所在象限停留時間。實驗期間，保持實驗室環(huán)境安靜，水迷宮水池周圍光線及物體保持不變，以減少外界環(huán)境干擾引起的實驗誤差。

1.4小鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px及T-AOC水平的檢測 水迷宮實驗結束后，將小鼠頸椎脫臼處死，用生理鹽水進行心臟灌流至肝臟發(fā)白，于冰盤上快速取出腦組織，取左側(cè)腦組織約100 mg制成10%勻漿，按照試劑盒說明書檢測腦組織勻漿SOD、MDA、GSH-Px及T-AOC水平。

1.5Tunel法測定小鼠海馬神經(jīng)元凋亡 取1.4中小鼠右側(cè)腦組織，于4%多聚甲醛溶液中固定，然后常規(guī)脫水、包埋及切片，按照Tunel細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作步驟觀察海馬神經(jīng)元凋亡情況。

1.6RT-PCR法檢測海馬組織CytC、Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達水平 從1.4中取出的腦組織分離適量海馬組織，加入RNA抽提試劑進行總RNA提取，然后根據(jù)RT-PCR實驗操作步驟進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR實驗。各待測基因引物序列如下，CytC上游引物：5'-TGCCTTCTTCGGAAACTGGG-3'， 下游引物：5'-CCGAACAGACCGTGGAGATT-3'，產(chǎn)物358 bp；Caspase-3上游引物：5'-TTGCCAGAAGATACCGGTGG-3'，下游引物：5'-TCGAATTCCGTTGCCACCTT-3'，產(chǎn)物195 bp；Bax上游引物：5'-TCTCCGGCGAATTGGAGATG-3'，下游引物：5'-CTCACGGAGGAAGTCCAGTG-3'，產(chǎn)物253 bp；Bcl-2上游引物：5'-ATAGCTGTTGCCCACTCGAC-3'，下游引物：5'-ATCTATGCCCAACAGGCCAC-3'，產(chǎn)物218 bp；β-actin Forward primer：5'-TTACAGGAAGTCCCTCACCC-3'， 下游引物：5'-ACACAGAAGCAATGCTGTCAC-3'，產(chǎn)物110 bp。將實驗所得PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠上進行電泳，以β-actin基因條帶為內(nèi)參，分析待測基因mRNA相對表達水平。

1.7Western印跡法檢測小鼠海馬組織CytC、Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達水平 從1.4中剝離的腦組織，取適量海馬組織，置于勻漿器中，加入1.0 ml RIPA蛋白裂解液，于冰上充分勻漿裂解約30 min，移入1.5 ml EP管中， 4℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清用BCA法測定各樣本提取物總蛋白濃度并調(diào)整一致，然后按照Western印跡步驟依次進行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、抗原封閉、一抗二抗孵育及電化學發(fā)光顯色等步驟，以β-actin條帶灰度值為內(nèi)參，分析待測蛋白相對表達值。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1SP對AD小鼠定位航行逃避潛伏期的影響 各組隨著訓練時間的延長，其定位航行逃避潛伏期都有逐漸縮短的趨勢(P>0.05)。與陰性對照組比較，第2、3及4天模型組定位航行逃避潛伏期均明顯延長(P<0.01)。與模型組比較，SP 600 mg/kg組、陽性藥對照組逃避潛伏期于第2、3及4天顯著縮短(P<0.05，P<0.01)，SP 300 mg/kg組逃避潛伏期于第3及4天顯著縮短(P<0.05)，但SP 150 mg/kg組雖然逃避潛伏期有所縮短，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

2.2SP對AD小鼠空間探索能力的影響 與陰性對照組比較，模型組穿越原跳臺位置次數(shù)明顯減少，在原跳臺所在象限停留時間明顯較短(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥對照組、SP 600、300 mg/kg組可明顯增加穿越原跳臺位置次數(shù)和所在象限停留時間(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表1 SP對AD小鼠定位航行逃避潛伏期的影響

與陰性對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

表2 SP對AD小鼠空間探索能力的影響

2.3SP對AD小鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px及T-AOC水平的影響 與陰性對照組比較，模型組腦組織SOD、GSH-Px及T-AOC水平顯著降低，MDA含量增多(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥對照組、SP 600 mg/kg組腦組織SOD、GSH-Px及T-AOC水平升高，MDA含量減少(P<0.05，P<0.01)；SP 300 mg/kg組腦組織GSH-Px及T-AOC水平升高，MDA含量減少(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表3 SP對AD小鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px及T-AOC水平的影響

2.4SP對AD小鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響 陰性對照組小鼠海馬神經(jīng)元排列整齊，胞膜完整，未見凋亡細胞；模型組海馬可見多量散在染色凋亡神經(jīng)元，細胞核固縮，呈棕褐色濃染；SP 600 mg/kg組海馬區(qū)可見少量染色凋亡神經(jīng)元，較模型組明顯減少。見圖1。

圖1 SP對AD小鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響(TUNEL染色，×400，箭頭為凋亡細胞)

2.5SP對AD小鼠海馬組織CytC、Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達水平的影響 與陰性對照組比較，模型組海馬組織CytC、Caspase-3及Bax mRNA表達水平顯著上調(diào)，Bcl-2 mRNA表達水平顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，SP 600 mg/kg組海馬組織CytC、Caspase-3及Bax mRNA表達水平顯著下降，Bcl-2 mRNA表達水平顯著上調(diào)(P<0.01)。見圖2，表4。

1：陰性對照組 2：模型組 3：SP 600 mg/kg組；下圖同圖2 SP對AD小鼠海馬組織CytC、Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達水平的影響

表4 SP對AD小鼠海馬組織CytC、Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達水平的影響

2.6SP對AD小鼠海馬組織CytC、Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達水平的影響 與陰性對照組比較，模型組海馬組織CytC、Caspase-3及Bax蛋白表達水平顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白表達水平顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，SP 600 mg/kg組海馬組織CytC、Caspase-3及Bax蛋白表達水平顯著下降，Bcl-2蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)。見表5，圖3。

表5 SP對AD小鼠海馬組織CytC、Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達水平的影響

圖3 SP對AD小鼠海馬組織CytC、Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達水平的影響

3 討 論

AD是臨床上常見的與年齡高度相關的中樞退行性疾病，往往伴有人格和情感的異常，嚴重影響患者的生活質(zhì)量〔10〕。研究表明，AD主要是由于Aβ沉積、老年斑(SP)形成等誘發(fā)神經(jīng)細胞氧化損傷、凋亡或死亡〔11,12〕。本研究表明SP對AD小鼠的學習、記憶和認知功能有一定的改善作用。

研究報道，氧化應激反應過強會產(chǎn)生多量的活性氧簇及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物等，導致神經(jīng)元胞膜或細胞器受損，從而影響神經(jīng)元功能甚至誘發(fā)神經(jīng)細胞凋亡或死亡〔13,14〕。氧化應激與凋亡共同參與了AD的發(fā)生發(fā)展，Aβ在腦組織發(fā)生纏結和不可逆沉積形成SP，從而活化氧自由基和炎癥因子等，引發(fā)過氧化應激和炎癥反應，細胞內(nèi)SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性下降，清除自由基及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA等)能力降低，神經(jīng)元線粒體膜通透性增加，大量CytC被釋放入胞質(zhì)中，活化Caspase-3，神經(jīng)細胞凋亡被啟動，促凋亡因子(Bax等)被激活，抗凋亡因子(Bcl-2等)被抑制，最終激活Caspase級聯(lián)反應導致神經(jīng)元凋亡，導致神經(jīng)元功能障礙或死亡，使機體出現(xiàn)學習、認知和記憶等中樞功能退化等臨床癥狀〔15～18〕。本研究結果提示，SP防治AD與其抑制氧化應激及抗細胞凋亡有關。