lncRNA PCAT19靶向miR-143-3p通過信號通路PI3K/Akt對甲狀腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機制

陳超 張偉麗 馮長松

(信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 信陽 464000)

甲狀腺癌是一種常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，其發(fā)病機制復(fù)雜，從分子層面研究、了解甲狀腺癌的發(fā)病機制有助于甲狀腺癌患者的個體精準(zhǔn)化治療〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(lncRNA)在多種類型癌癥中的失調(diào)表達(dá)與癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，然而它們在甲狀腺癌中的作用和分子機制仍不完全清楚〔2〕。前列腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(PCAT)是一種lncRNA，PCAT1與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后密切相關(guān)〔3〕。PCAT19是PCAT家族成員之一，有研究發(fā)現(xiàn)長同型PCAT19調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長和轉(zhuǎn)移，可通過lncRNA PCAT19驅(qū)動前列腺癌的進(jìn)展〔4〕；此外，PCAT19通過調(diào)節(jié)miR-182/丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)4和代謝平衡促進(jìn)喉癌細(xì)胞的增殖和腫瘤發(fā)生〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在不同類型的甲狀腺癌中表達(dá)異常，表明miRNA可能在甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用〔6〕。研究報道m(xù)iR-143-3p通過靶向RNA結(jié)合蛋白quaking(QKI)-5在食管鱗狀細(xì)胞癌中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，起到抑制腫瘤的作用〔7〕。miR-143-3p通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)7的表達(dá)抑制人乳腺癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲〔8〕。miR-143-3p在甲狀腺乳頭癌中下調(diào)表達(dá)，但作用機制不清楚〔9〕。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，也是甲狀腺癌中一條重要的信號傳導(dǎo)通路，與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)〔10〕。有研究發(fā)現(xiàn)干擾胰島素受體底物(IRS)-1通過抑制PI3K/AKT信號通路激活能降低人乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞的生存能力和轉(zhuǎn)移能力〔11〕。然而PCAT19及miR-143-3p對甲狀腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機制尚不清楚，本實驗旨在研究PCAT19及miR-143-3p對甲狀腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及PCAT19是否通過調(diào)控miR-143-3p和PI3K/AKT信號通路影響甲狀腺癌細(xì)胞增殖和凋亡。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑 甲狀腺癌細(xì)胞BCPAP、TPC-1、SW1736和正常甲狀腺細(xì)胞HT-ori3均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自上海玉博生物科技有限公司；Trizol試劑、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自上海君瑞生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；MTT試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠(Annexin V-FITC/PI)試劑盒購自上海一研生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將甲狀腺癌細(xì)胞BCPAP、TPC-1、SW1736和正常甲狀腺細(xì)胞HT-ori3置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對數(shù)生長期甲狀腺癌細(xì)胞BCPAP，將miR-con、miR-143-3p、si-con、si-PCAT19、pcDNA和pcDNA-PCAT19質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至BCPAP細(xì)胞中，記為miR-con組、miR-143-3p組、si-con組、si-PCAT19組、pcDNA組和pcDNA-PCAT19組；未進(jìn)行任何處理的甲狀腺癌細(xì)胞BCPAP作為對照(NC)組；將si-PCAT19分別與anti-miR-con和anti-miR-143-3p質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至BCPAP細(xì)胞中，分別記為si-PCAT19+anti-miR-con組和si-PCAT19+anti-miR-143-3p組，轉(zhuǎn)染均按照LipofectamineTM 2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.4qRT-PCR檢測miR-143-3p和PCAT19表達(dá)水平 用Trizol提取細(xì)胞總RNA，RNA定量后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照PCR試劑盒以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)。相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。

1.5Western印跡檢測細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)-3、磷酸化(p)-AKT、磷脂酰肌醇3-激酶的P110α催化亞基(PI3Kp110α)蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，檢測蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后將蛋白樣品轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉液室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，加入二抗(1∶2 000)孵育2 h，曝光顯影、定影、用Quantity One軟件檢測蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和內(nèi)參β-actin條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.6MTT檢測細(xì)胞存活率 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；加入 DMSO振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細(xì)胞增殖存活率(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞后用預(yù)冷的PBS，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，依次加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。實驗重復(fù)3次。

1.8熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測PCAT19對miR-143-3p的靶向調(diào)控 構(gòu)建含miR-143-3p結(jié)合位點的PCAT19野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體(WT-PCAT19和MUT-PCAT19)，將其分別與miR-con和miR-143-3p共轉(zhuǎn)染至BCPAP細(xì)胞中。按說明書檢測熒光素酶活性，實驗重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1甲狀腺癌細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA PCAT19和miR-143-3p的表達(dá) HT-ori3相比，BCPAP、TPC-1、SW1736中PCAT19 mRNA的表達(dá)水平顯著升高，miR-143-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)?？梢姡诩谞钕侔┘?xì)胞系中，lncRNA PCAT19高表達(dá)，miR-143-3p低表達(dá)。見表1。

表1 甲狀腺癌細(xì)胞和正常甲狀腺細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA PCAT19和miR-143-3p的表達(dá)

與HT-ori3比較:1)P<0.05

2.2敲低PCAT19抑制甲狀腺癌BCPAP增殖，誘導(dǎo)凋亡 與NC組及si-con組相比，si-PCAT19組PCAT19、CyclinD1表達(dá)水平顯著降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，BCPAP細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖1、圖2、表2。可見，敲低PCAT19抑制與BCPAP細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖1 CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

NC組、si-con組、si-PCAT19組圖2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

表2 敲低PCAT19抑制甲狀腺癌BCPAP增殖，誘導(dǎo)凋亡

與si-PCAT19組比較：1)P<0.05

2.3高表達(dá)miR-143-3p抑制BCPAP增殖，誘導(dǎo)凋亡 與miR-con組相比，miR-143-3p組miR-143-3p、Cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著升高，CyclinD1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。可見，高表達(dá)miR-143-3p抑制BCPAP細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。見圖3、表3。

圖3 NC組、miR-con組、miR-143-3P組CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

表3 高表達(dá)miR-143-3p抑制BCPAP甲狀腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡

與miR-con組比較：1)P<0.05

2.4lncRNA PCAT19靶向miR-143-3p表達(dá) 通過starbase在線軟件預(yù)測到PCAT19與miR-143-3p存在結(jié)合位點(圖4)。轉(zhuǎn)染野生型PCAT19表達(dá)載體后，相較于miR-con組，miR-143-3p組甲狀腺癌細(xì)胞BCPAP的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染突變型PCAT19表達(dá)載體后，甲狀腺癌細(xì)胞BCPAP的熒光素酶活性差異不顯著。見表4。相較于pcDNA組(0.35±0.05)，pcDNA-PCAT19組(0.10±0.02)，miR-143-3p的表達(dá)水平顯著降低；相較于si-con組(0.32±0.03)，si-PCAT19組miR-143-3p的表達(dá)水平顯著升高(3.88±0.39，P<0.05)。可見，PCAT19可靶向調(diào)控miR-143-3p的表達(dá)。

圖4 通過starbase對PCAT19和miR-143-3p結(jié)合進(jìn)行預(yù)測

表4 miR-con或miR-143-3p與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BCPAP細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測

2.5miR-143-3p低表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)PCAT19低表達(dá)對BCPAP增殖和凋亡的影響 與si-PCAT19+anti-miR-con組相比，si-PCAT19+anti-miR-143-3p組miR-143-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，CyclinD1表達(dá)水平顯著升高，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5、表5?？梢姡琺iR-143-3p低表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)PCAT19低表達(dá)對BCPAP增殖抑制和凋亡促進(jìn)的作用。

2.6PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 與si-con組相比，si-PCAT19組p-AKT、PI3Kp110α表達(dá)水平顯著降低；與si-PCAT19+anti-miR-con組相比，si-PCAT19+anti-miR-143-3p組p-AKT、PI3Kp110α表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。可見，敲減PCAT19可以抑制PI3K/AKT信號通路p-AKT、PI3Kp110α的表達(dá)，而miR-143-3p低表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)PCAT19低表達(dá)對p-AKT、PI3Kp110α的表達(dá)的抑制作用。見表5、圖6。

1～4:si-con組;si-PCAT19組;si-PCAT19+anti-miR-con組;si-PCAT19+anti-miR-143-3p組；圖6同圖5 各組CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

表5 miR-143-3p低表達(dá)對細(xì)胞增殖、侵襲和遷移及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與si-con組比較：1)P<0.05；與si-PCAT19+anti-miR-con組比較：2)P<0.05

圖6 Western印跡檢測p-AKT和PI3Kp110α的表達(dá)

3 討 論

甲狀腺癌近年來發(fā)病率逐漸升高，嚴(yán)重危害人類健康，研究可用于甲狀腺癌診斷和預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物及治療靶點，對臨床具有重要意義〔12〕。lncRNA 和miRNA均屬于非編碼RNA，參與甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程，可作為甲狀腺癌診斷、預(yù)后的標(biāo)志物及治療靶點〔13,14〕。PCAT1、PCAT7與PCAT19同屬PCAT家族，有研究報道PCAT-1過表達(dá)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKN)1A促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移〔15〕；PCAT-1還促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲，并且與前列腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)〔16〕；PCAT19也促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展〔4〕。過表達(dá)PCAT7通過抑制miR-134-5p可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移〔17〕。以上結(jié)果表明上調(diào)表達(dá)的PCAT均促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，本實驗結(jié)果顯示，PCAT19在甲狀腺癌細(xì)胞中與上調(diào)表達(dá)，敲低PCAT19可抑制Cyclin D1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)；抑制甲狀腺癌細(xì)胞BCPAP增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。且PCAT19靶向負(fù)調(diào)控miR-143-3p。

有研究報道沉默lncRNA肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MALAT)1可通過miR-143-3p調(diào)節(jié)鋅指E-box結(jié)合同源異型盒轉(zhuǎn)錄因子(ZEB)1表達(dá)進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲〔18〕。在宮頸癌組織和細(xì)胞系中miR-143-3p低表達(dá)，敲低lncRNA HOX反義基因組RNA(HOTAIR)通過上調(diào)miR-143-3p能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔19〕。miR-143-3p在創(chuàng)傷后增生性瘢痕組織和成纖維細(xì)胞中也顯著下調(diào)表達(dá)，miR-143-3p通過AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑靶向結(jié)締組織生長因子(CTGF/CCN2)可抑制增生性瘢痕形成〔20〕。以上結(jié)果表明，miR-143-3p可被lncRNA調(diào)控進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展，且其也可以靶向調(diào)控下游信號通路或靶基因而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本實驗研究結(jié)果顯示，miR-143-3p在甲狀腺癌細(xì)胞中也呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-143-3p抑制CyclinD1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)；抑制甲狀腺癌細(xì)胞BCPAP增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。且miR-143-3p受lncRNA PCAT19的靶向調(diào)控，miR-143-3p低表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)PCAT19低表達(dá)對BCPAP細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)的作用；還逆轉(zhuǎn)了PCAT19低表達(dá)對p-AKT和PI3Kp110α的抑制作用。

AKT和PI3Kp110α是PI3K/AKT信號通路中的作用分子，PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化可使甲狀腺細(xì)胞異常增殖，促進(jìn)甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)生、發(fā)展〔21〕。研究發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑通過抑制p-AKT的表達(dá)可抑制甲狀腺未分化癌HTH-15細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞侵襲能力〔22〕。下調(diào)PI3K/AKT信號通路可抑制甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲〔23〕；通過抑制甲狀腺癌細(xì)胞中PI3K/AKT途徑可增強TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔24〕。以上結(jié)果均表明PI3K/AKT信號通路在甲狀腺癌中起致癌作用，抑制該通路的激活可抑制甲狀腺癌的進(jìn)展。本實驗中敲低PCAT19抑制甲狀腺癌細(xì)胞BCPAP增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。且敲低PCAT19抑制p-AKT和PI3Kp110α的表達(dá)，即抑制PI3K/AKT信號通路的激活；此外，miR-143-3p低表達(dá)可逆轉(zhuǎn)PCAT19低表達(dá)對p-AKT和PI3Kp110α的抑制作用。提示PCAT19可能通過miR-143-3p進(jìn)而調(diào)控PI3K/AKT信號通路，從而影響甲狀腺癌細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上所述，lncRNA PCAT19可抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，其機制可能與miR-143-3p及PI3K/AKT信號通路有關(guān)，將可為甲狀腺癌的預(yù)防、治療和預(yù)后提供新的生物標(biāo)志物和新靶點。