黃葵膠囊對阿霉素腎病大鼠腎組織MCP-1表達及對腎組織病理損傷的影響

趙塔娜，蔡棟梁，苑露丹

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院 1.兒二科；2.老年病科,黑龍江 佳木斯154001)

腎臟疾病的進展過程由多種細胞炎性因子參與其中，最終進展為終末期腎病(ESDR)。MCP-1在單核細胞趨化以及促腎臟纖維化過程中扮演著十分重要的角色[1]。近年來，黃葵及其提取物制劑被廣泛地應用于各種類型的腎臟疾病之中，其臨床療效較為理想[2]。本研究主要采用基礎(chǔ)實驗的方法，探討了黃葵膠囊對AN大鼠腎組織MCP-1的表達情況及其對腎組織病理損傷產(chǎn)生的影響，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物選擇佳木斯大學動物培養(yǎng)中心提供的30只清潔級雄性SD大鼠作為實驗動物，體重范圍為108 g-134 g，平均(119.78±10.98) g。使用標準飼料進行飼養(yǎng)，自由攝食、進水。

1.2 藥物及試劑阿霉素(ADR)：海正輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批準文號：國藥準字H33021980號；黃葵膠囊：江蘇蘇中藥業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)，批準文號：國藥準字Z19990040號；MCP-1抗體、二抗均購自于上海鈺博生物科技有限公司；免疫組化染色試劑盒購自于上海聯(lián)邁生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1動物建模 首先取健康SD雄性大鼠于尾靜脈一次性注入6.5 mg/kg的鹽酸阿霉素，于第7 d及第14 d置于代謝籠中，留24 h尿液，并注意對小鼠尿蛋白進行測定分析。如果24 h尿蛋白定量在100 mg以上，則表明動物造模已成功。

1.3.2動物分組及藥物干預 正常組大鼠10只，剩余的20只為建模大鼠。根據(jù)隨機數(shù)字表法，隨機分為模型對照組(n=10)及治療組(n=10)。黃葵治療方法為：每次給藥1粒，溶化成藥液，3次/d，給藥劑量為2.0 g/(kg·d)，給藥方式為灌胃，1個療程為8周，正常組與模型對照組均給予與黃葵等量的生理鹽水灌胃，同樣為8周。根據(jù)體表面積公式：A=K×W2/3，對大鼠每天所需要的藥物劑量進行計算。

1.4 檢測項目及方法

1.4.124 h尿蛋白 在灌注藥物及生理鹽水后第2周及第8周時，放置代謝籠，并留取24 h尿液，使用考馬斯亮藍法對24 h尿蛋白定量指標水平進行檢測分析。

1.4.2血生化指標 實驗第2周及第8周時，每組均分別采取斷椎法處死大鼠，于股動脈取血，經(jīng)離心后取上清液，使用貝克曼庫爾特AU5800型全自動生化分析儀對血肌酐(Scr)及血白蛋白(Alb)水平進行檢測分析。

1.4.3腎組織形態(tài) 將處死過的大鼠腎臟皮質(zhì)溶于濃度為10%的福爾馬林溶液中進行固定，使用石蠟包埋之后，再行HE染色，然后于光鏡下對腎組織病理改變情況進行觀察。

1.4.4SP法檢測腎組織MCP-1蛋白的表達情況 按試劑盒說明書操作。在圖像采集分析系統(tǒng)下，于每張切片上隨機采集5個不重疊的視野，棕黃色部分則表示為MCP-1陽性表達。采用Image圖像分析軟件對圖像進行分析，對每個視野中的腎間質(zhì)陽性染色總面積進行測量，取均值。MCP-1在腎組織陽性表達指數(shù)=陽性信號面積/視野面積。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況各組大鼠在建模之前反應比較靈敏，毛發(fā)光滑度佳。大鼠建模3 d之后，大鼠發(fā)生精神萎靡、活動減少等方面的情況，部分大鼠發(fā)生體毛稀疏、反應遲鈍等情況，上述癥狀在模型對照組中表現(xiàn)更為顯著，黃葵治療組整體情況要比模型對照組好。

2.2 各組24 h尿蛋白定量變化情況對比第2周、第8周模型對照組與治療組24 h尿蛋白定量水平均高于相應時點的正常大鼠24 h尿蛋白定量水平(P均<0.05)，且治療組第2周、第8周時24 h尿蛋白定量水平均分別顯著小于模型對照組對應時點的24 h尿蛋白定量水平(P均<0.05)，見表1。

表1 各組24 h尿蛋白定量變化情況比較

注：與正常對照組比較，①P<0.05；與模型對照組比較，②P<0.05.

2.3 各組大鼠血生化指標水平對比第2周、第8周模型對照組與治療組血Scr水平均高于相應時點的正常對照組大鼠血Scr水平(P均<0.05)，且治療組第2周、第8周時血Scr水平均分別顯著小于模型對照組對應時點的血Scr水平(P均<0.05)；第2周、第8周模型對照組與治療組血Alb水平均低于相應時點的正常對照組大鼠血Alb水平(P均<0.05)，且治療組第2周、第8周時血Alb水平均分別顯著高于模型對照組對應時點的血Alb水平(P均<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠生化指標水平比較

注：與正常對照組比較，①P<0.05；與模型對照組比較，②P<0.05.

2.4 各組大鼠不同時點腎組織光鏡檢查結(jié)果對比光鏡HE染色結(jié)果：經(jīng)光鏡檢查，正常對照組大鼠腎小球、腎間質(zhì)、腎小管等均正常。第2周末時，模型對照組少數(shù)大鼠腎小球存在基質(zhì)與系膜細胞輕度增生，有少量腎小球包氏囊厚度增大，球囊發(fā)生粘連現(xiàn)象，少量腎小管出現(xiàn)擴張，剩下大鼠的腎組織無顯著異常現(xiàn)象(見下圖1所示)；第8周末時，模型組大鼠腎小球存在局灶節(jié)段硬化的現(xiàn)象，出現(xiàn)包氏囊厚度增加以及球囊出現(xiàn)粘連，某些腎小管出現(xiàn)萎縮，部分腎間質(zhì)出現(xiàn)纖維化現(xiàn)象，且在光鏡下可探查局灶性炎癥細胞發(fā)生浸潤反應。在同一時間節(jié)點，治療組大鼠腎臟病變較模型組大鼠要更加輕微(見下圖2所示)。

圖1 實驗2周末時各組腎組織切片光鏡HE染色(×40)

圖2 實驗8周末時各組腎組織切片光鏡HE染色(×40)

2.5 各組大鼠不同時點腎組織MCP-1陽性表達情況對比第2周、第8周模型對照組與治療組MCP-1在腎組織陽性表達指數(shù)均高于相應時點的正常對照組大鼠MCP-1在腎組織陽性表達指數(shù)(P均<0.05)，且治療組第2周、第8周時MCP-1在腎組織陽性表達指數(shù)均分別顯著小于模型對照組對應時點的MCP-1在腎組織陽性表達指數(shù)(P均<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠不同時點腎組織MCP-1陽性表達情況比較

注：與正常對照組比較，①P<0.05；與模型對照組比較，②P<0.05.

3 討論

阿霉素腎病模型與人類微小病變型腎病相類似，該模型主要采取雄性大鼠或者SD大鼠尾靜脈單次注射5-7.5 mg/kg的阿霉素，在ADR注射入大鼠體內(nèi)4-5 d之后出現(xiàn)尿蛋白現(xiàn)象，14 d后尿蛋白水平會出現(xiàn)峰值，然后發(fā)生典型性的腎病表現(xiàn)，伴隨浮腫、高脂血癥、低蛋白血癥等并發(fā)癥，上述癥狀持續(xù)時間一般在半年以上。本研究所采用的大鼠，平均體重(119.78±10.98)g，尾靜脈注射ADR劑量為6.5 mg/kg。與正常對照組相比，模型對照組大鼠表現(xiàn)精神狀況較萎靡，出現(xiàn)短時間腹瀉癥狀，納差，體重顯著下降。模型對照組大鼠在尾靜脈注射ADR后一周，尿蛋白水平顯著升高，到第2周時，模型組(模型對照組、治療組)大鼠24 h尿蛋白定量均遠遠超過100 mg，且模型組24 h尿蛋白定量顯著高于正常對照組(P均<0.05)，此結(jié)果提示：本研究大鼠造模非常成功。

MCP-1的表達主要受核轉(zhuǎn)錄因子-β(NF-β)與轉(zhuǎn)錄活化蛋白1(TAP-1)之間的協(xié)調(diào)作用所決定的。曹陽等[3]通過綜述的方法，闡述了MCP-1與腎病綜合征之間的關(guān)系。所以，將腎組織中的MCP-1的過度表達進行抑制，能夠有效降低單核細胞、中性粒細胞同血管內(nèi)皮細胞之間的黏附作用，對單核細胞趨化以及激活單核細胞釋放出的各種細胞因子進行抑制，從而使得腎臟損傷程度得以顯著減小，蛋白尿水平顯著下降[4]。

現(xiàn)代藥理研究證實：黃葵中包括槲皮素、楊梅黃素等在內(nèi)的5種黃酮類化合物單體，具有抗腎小球免疫炎性反應、降低尿蛋白水平以及抗血小板聚集、保護腎臟功能等方面的效果[5-10]。本研究結(jié)果提示：黃葵膠囊能夠有效降低ADR腎病大鼠24 h尿蛋白量、血Scr水平及MCP-1陽性表達指數(shù)，提高血Alb水平。此外，本研究結(jié)果還顯示：黃葵還能夠有效保護ADR腎病大鼠的腎臟組織。陳洪宇等[11]探討了中藥防己黃芪湯加減治療阿霉素腎病大鼠的療效及其對大鼠腎組織MCP-1的影響，經(jīng)腎組織切片光鏡HE染色，結(jié)果顯示：治療組治療8周后腎組織未見明顯異常狀況，且治療組治療8周后腎組織MCP-1表達的陽性指數(shù)均較模型對照組顯著下降(P均<0.05)，本研究結(jié)果與其相類似。

綜上所述，黃葵膠囊能夠降低ADR腎病大鼠24 h尿蛋白量、血Scr及MCP-1陽性表達指數(shù)及提高血Alb水平，改善大鼠腎組織功能。