CD16/CD13表達(dá)模式可以有效鑒別粒細(xì)胞相關(guān)疾病

王 卉，王愛先，甄軍毅，吳雪英，陳 曼，宮美維，宋雨竹，李 蘭

(1.河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院 檢驗科，河北 廊坊065201；2.北京曠博生物技術(shù)股份有限公司，北京100176)

CD16是流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)育階段粒細(xì)胞常用標(biāo)志，因其編碼基因和抗體的復(fù)雜性，一些相關(guān)疾病呈現(xiàn)相似又不同的表型，需要加以區(qū)分。CD13表達(dá)強度隨著粒細(xì)胞分化成熟而變化，所以CD16/CD13是臨床監(jiān)測粒細(xì)胞發(fā)育情況的常用抗體組合。本文介紹正常對照以及幾種容易誤診的粒細(xì)胞相關(guān)疾病的CD16及CD16/CD13表達(dá)模式，以研究其在鑒別不同疾病中的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑四色 FACSCalibur及八色FACSCanto流式細(xì)胞儀均購自美國Becton Dickinson(BD)公司。熒光標(biāo)記嗜水氣單胞菌溶素(Fluorescein-labeled proaerolysin，F(xiàn)LAER)為加拿大CEDARLANE公司產(chǎn)品,其余單抗均為美國BD公司產(chǎn)品(其中CD16為BD Pharmingen產(chǎn)品)。

1.2 標(biāo)本選擇2011年12月到2017年12月在北京市道培醫(yī)院和河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院就診的病例。隨機選取正常對照50例；隨機選取骨髓增生異常綜合征(MDS)50例；全部夜間陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)62例；全部粒細(xì)胞丟失CD16排除MDS和PNH后，疑診為Fcγ受體Ⅲ類B(FcγRⅢB)基因缺失患者11例(包括1例供者)。

1.3 抗體標(biāo)記及流式細(xì)胞儀獲取按照陸道培醫(yī)院流式細(xì)胞室常規(guī)操作[1]。粒細(xì)胞發(fā)育階段的觀察使用CD16/CD13/CD45/CD11b抗體組合，單核細(xì)胞的評價使用CD14/CD64/CD45/CD11c組合。髓系原始細(xì)胞性質(zhì)判斷使用CD34和(或)CD117設(shè)門，觀察CD7、CD56、CD19、HLA-DR、CD33、CD13、CD11b、CD15、CD96等標(biāo)志是否存在異常表達(dá)。使用FLAER/CD64/CD45/CD14抗體組合以及紅細(xì)胞和粒細(xì)胞的CD55、CD59評價PNH克隆。

2 結(jié)果

50例正常對照，發(fā)育階段粒細(xì)胞CD16/CD13表達(dá)相似，均呈現(xiàn)“對勾”形狀。其他免疫表型有：髓系原始細(xì)胞無異常表達(dá)，紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55、CD59，粒細(xì)胞和單核細(xì)胞CD55、CD59、FLAER均無明顯丟失。

50例MDS患者粒細(xì)胞CD16/CD13表達(dá)模式異常。主要表現(xiàn)為：CD16的表達(dá)多呈現(xiàn)不同程度的延續(xù)性；因為CD13和CD16抗原表達(dá)強度改變或者分布異常導(dǎo)致的粒細(xì)胞CD16/CD13發(fā)育模式異常。其他伴隨免疫表型有：常同時伴有粒細(xì)胞顆粒性減低、粒細(xì)胞CD11b/CD13發(fā)育模式異常等改變；髓系原始細(xì)胞可能會出現(xiàn)異常表達(dá)；原始細(xì)胞中CD19+B祖細(xì)胞占比減低；單核細(xì)胞異常表達(dá)；有核紅細(xì)胞比例升高、細(xì)胞變大、異常表達(dá)等。

62例PNH患者粒細(xì)胞CD16/CD13表達(dá)模式與正常對照不同，非常有特征性：CD16不同程度部分丟失；陰性和陽性細(xì)胞之間有明顯界限；陰性部分不是CD16完全丟失，而是呈現(xiàn)弱陽性。其他伴隨免疫表型有：同時出現(xiàn)粒細(xì)胞CD24、單核細(xì)胞CD14等GPI相關(guān)蛋白的丟失；紅細(xì)胞CD55、CD59，粒細(xì)胞和單核細(xì)胞CD55、CD59、FLAER的陰性細(xì)胞比例升高。

與其他粒細(xì)胞相關(guān)疾病不同，11例疑診為FcγRⅢB基因缺失患者粒細(xì)胞CD16完全丟失(見圖1)。除此之外無異常表達(dá)，CD55、CD59、FLAER表達(dá)無缺失。

3 討論

CD16抗原是人類FcγⅢ類受體(FcγRⅢ)，由位于1q22染色體上的FcγRⅢA和FcγRⅢB兩個基因編碼。前者主要表達(dá)于NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，后者是一個糖基化磷脂酰肌醇(GPI)膜錨蛋白，只表達(dá)于粒細(xì)胞。所以FcγRⅢB基因缺失的患者、由于GPI蛋白缺陷導(dǎo)致的PNH病例，粒細(xì)胞CD16表達(dá)發(fā)生改變，而NK細(xì)胞的CD16表達(dá)不受影響[2]。

CD16的抗體復(fù)雜，文獻(xiàn)報道不同克隆的抗體針對不同位點：泛-FcγRⅢ CD16單克隆抗體主要包括：CLBFcRgranl (mIgG2a)、3G8 (mIgGl)、DJ13Oc (mIgGl)、BW209i2 (mIgG2a)；其他大多數(shù)克隆只針對部分位點，所以根據(jù)研究目的使用不同克隆抗體。臨床免疫分型檢測因為需要診斷和鑒別診斷各種疾病或者多態(tài)性，所以建議使用泛-FcγRⅢ CD16單克隆抗體。本文中使用的是3G8抗體。CD13熒光強度隨著粒細(xì)胞分化成熟發(fā)生改變，所以臨床常用CD16/CD13表達(dá)模式觀察粒細(xì)胞發(fā)育情況。

圖1 使用骨髓粒細(xì)胞CD16/CD13表達(dá)模式鑒別粒細(xì)胞相關(guān)疾病。顯示細(xì)胞群為發(fā)育階段粒細(xì)胞。a.健康對照。粒細(xì)胞CD16/CD13呈現(xiàn)對勾形狀。b.MDS病例。粒細(xì)胞CD16/CD13發(fā)育模式異常，CD16表達(dá)為延續(xù)性的分布異常。c.PNH病例。粒細(xì)胞CD16部分丟失，陰性和陽性之間有明顯界限，陰性部分呈現(xiàn)弱陽性表達(dá)。D.疑診FcγRⅢB基因缺失病例。粒細(xì)胞CD16完全丟失。

粒細(xì)胞CD16和CD16/CD13表達(dá)異常主要見于幾種情況：MDS[3]或者M(jìn)DS/MPN、PNH[4]、FcγRⅢ B基因缺失[2]，此外有些感染、營養(yǎng)性貧血也可以出現(xiàn)粒細(xì)胞的CD16/CD13異常。但是只有FcγRⅢ B基因缺失是CD16完全丟失，其他疾病多少都會殘留一些CD16的表達(dá)。

MDS或者M(jìn)DS/MPN的粒細(xì)胞CD16表達(dá)為延續(xù)性分布異常，導(dǎo)致CD16/CD13發(fā)育模式異常，同時伴有CD11b/CD13的發(fā)育模式異常。此外還會伴有粒細(xì)胞的其他異常表現(xiàn)，髓系原始細(xì)胞的異常、紅細(xì)胞和巨核異常、單核細(xì)胞異常、原始細(xì)胞中B祖細(xì)胞占比減低等，文獻(xiàn)[3]報道流式細(xì)胞術(shù)免疫分型診斷MDS的靈敏度為69%-98%，特異性78%-93%。結(jié)合臨床病史、骨髓形態(tài)學(xué)、染色體、基因突變等檢查會提供更多診斷信息。MDS是臨床上出現(xiàn)血細(xì)胞減少時首要想到的診斷之一，因此在經(jīng)驗不足的情況下，出現(xiàn)粒細(xì)胞CD16/CD13表達(dá)模式異常時，也是容易誤診為該疾病。

PNH[4]克隆大小差別很大，因此粒細(xì)胞CD16/CD13的表達(dá)模式也會有不同。文章中的62例患者，CD16/CD13能看到的克隆大小1%-99%(中位數(shù)75%)。外周血因為均為表達(dá)CD16的成熟階段粒細(xì)胞，因此觀察靈敏度較高。骨髓因為存在CD16陰性的早幼粒和中晚幼粒階段細(xì)胞，所以少量的缺失容易被掩蓋，尤其是與MDS同時發(fā)生的時候。PNH的CD16丟失非常有特征性：不像MDS的延續(xù)性分布異常，而是陰性和陽性之間有明顯界限；陰性部分呈現(xiàn)弱表達(dá)，而非FcγRⅢB基因缺失那樣的完全陰性。有研究認(rèn)為，CD16細(xì)胞表面FcγRⅢB比GPI分子大，可能存在GPI以外的結(jié)合位點和信號通道，導(dǎo)致PNH的CD16陰性部分呈現(xiàn)背景升高，非完全陰性。

與MDS、PNH相比，F(xiàn)cγRⅢB基因缺失發(fā)病率相對較高，但是因為絕大多數(shù)沒有明顯臨床表現(xiàn)，很多見于正常人，加上是除了流式細(xì)胞術(shù)以外，大多數(shù)其他檢測方法(尤其是第一道篩查項目形態(tài)學(xué))無法發(fā)現(xiàn)的疾病，因此非常容易被臨床忽略。文獻(xiàn)報道粒細(xì)胞相關(guān)FcγRⅢB基因缺失在白人中發(fā)生率為0.1%，此外還有3%左右是雜合子[2]。在中國人中發(fā)病率尚無報道。因至少一系減少或者健康供者來陸道培醫(yī)院做免疫分型的患者中，排除其他影響因素后疑診為FcγRⅢB基因缺失的患者檢出率為0.2%。但是除了少數(shù)供者以外未包括大多數(shù)健康人，故數(shù)據(jù)統(tǒng)計缺乏人群代表性；而且研究只是排除其他疾病后推測，并未做相關(guān)基因檢測，所以可能造成推測的陽性率高于文獻(xiàn)報道[2]。但是也說明粒細(xì)胞相關(guān)的FcγRⅢB基因缺失或者說多態(tài)性的發(fā)生率可能并不低。雖然研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cγRⅢB基因缺失患者因為存在FcγRⅢA，所以大多數(shù)人并沒有嚴(yán)重感染，且最初是在健康獻(xiàn)血員和供者中發(fā)現(xiàn)[2]，故認(rèn)為是一種可以忽略的正常人群多態(tài)性，但是在臨床診斷中，因為CD16的表達(dá)缺失會造成CD16/CD13表達(dá)模式異于正常，經(jīng)驗不足的情況下容易誤診為MDS等其他粒細(xì)胞相關(guān)疾病，所以流式檢測醫(yī)師應(yīng)該正確認(rèn)識這種疾病。

總之，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測髓系CD16/CD13表達(dá)，不同粒細(xì)胞相關(guān)疾病會呈現(xiàn)各自特征性表達(dá)模式。其中FcγRⅢB基因缺失雖然發(fā)病率高但卻是臨床容易忽略的問題，PNH也會造成CD16/CD13表達(dá)異常，經(jīng)驗不足的時候這些疾病均容易誤診為MDS。而正確認(rèn)識流式細(xì)胞術(shù)檢測粒細(xì)胞CD16/CD13免疫表型，可以簡單有效鑒別這些相關(guān)疾病。