染色體核型分析聯(lián)合快速MLPA非整倍體技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

鄧國生

(廣西壯族自治區(qū)玉林市婦幼保健院 檢驗科，廣西 玉林537000)

染色體核型分析技術(shù)是檢查人類染色體金標準方法，但染色體核型分析技術(shù)要細胞培養(yǎng)，檢測時間長，操作程序復(fù)雜，技術(shù)要求高，2002年荷蘭White和Schouten創(chuàng)建了多重鏈接依賴性探針擴增技術(shù)(MLPA)[1-3]，MLPA不用細胞培養(yǎng)，是一種快速簡單的檢測方法。為了探討染色體核型分析聯(lián)合MLPA非整倍體技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值，對2000例有產(chǎn)前診斷指征孕婦羊水，分別采用染色體核型分析和MLPA非整倍體技術(shù)檢查，結(jié)果總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 資料

2018年1月至2018年6月，在玉林市婦幼保健院優(yōu)生遺傳科就診的2000例有產(chǎn)前診斷指征孕婦，同意行羊膜腔穿刺抽取羊水，并簽署知情同意書。其孕周在18-24周，年齡在(16-45)歲之間。進行染色體檢查及MLPA非整倍體檢測。

1.2 儀器與試劑

儀器：黑馬TGL-16H臺式高速離心機，K30B干式恒溫器，PCR梯度擴增儀，ABI 3500基因分析儀，美國Formar CO2培養(yǎng)箱，潔凈工作臺。試劑：DNA提取液，荷蘭MLPA試劑盒(P095)，廣州白云山羊水培養(yǎng)基、美國張氏培養(yǎng)基。

1.3 羊水細胞培養(yǎng)、制備及染色體核型分析

在羊水穿刺前均告知孕婦及其家屬進行羊水染色體分析的產(chǎn)前診斷范圍與風(fēng)險，并簽署知情同意書。在無菌條件下，經(jīng)B超引導(dǎo)定位下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水26 ml，分別置于3支15 ml無菌離心管中，其中1支6 ml羊水送至分子遺傳實驗室做MLPA P095檢測。1 500轉(zhuǎn)/分離心10 min，在超凈工作臺無菌操作，去上清液后分別加入5ml兩種不同廠家培養(yǎng)基，用無菌吸管吹打混勻，并分別放入兩個不同廠家培養(yǎng)瓶于兩個獨立的37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7-8天，在倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞克隆大小并進行換液，繼續(xù)培養(yǎng)1-2天后觀察發(fā)現(xiàn)有6-8個集落均為圓形透亮的細胞時加入秋水仙素阻斷，收獲、制片和G顯帶，并進行核型分析。根據(jù)人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2013)標準進行描述染色體核型，并出具染色體核型分析報告。

1.4 MLPA方法

按羊水的DNA提取、PCR擴增、毛細管電泳及結(jié)果分析等步驟進行[4]。

2 結(jié)果

2.1 羊水細胞染色體核型分析

羊水染色體培養(yǎng)2000例，培養(yǎng)成功率100%，其中檢測出異常染色體62例，檢出率31.00‰，異常染色體中數(shù)量最多前6位為47,Xn,+21核型18例;47,Xn,+18核型6例;46,X,inv(Y)(p11q11)核型4例;45,Xn,der(13;14)(q10;q10)核型2例;47,XYY核型2例;46,Xn,del(22)(p11.2)核型2例。結(jié)構(gòu)異常22例，嵌合體12例。見表1。

2.2 多重鏈接依賴性探針擴增技術(shù)非整倍體檢查

羊水MLPA檢測2000例，檢測成功率100%，檢測出異常染色體31例，陽性率15.50‰，其中47,Xn,+21核型18例;47,Xn,+18核型7例;47,Xn,+13核型1例;47,XXY核型 1例;47,XYY核型 2例;45,X嵌合體1例;47,XXY嵌合體1例。見表2。

3 討論

本研究表明，可以看出MLPA檢測21、18、13、X、Y染色體非整倍體時，結(jié)果與核型分析100%符合，易倍型18三體與核型分析100%符合，45,X嵌合體、47,XXY嵌合體也與核型分析100%相符合。MLPA對于染色體平衡易位、一些非平衡易位、倒位等檢測不出。染色體核型分析檢測有產(chǎn)前診斷指征孕婦異常染色體核型檢出率31.00‰遠遠高于MLPA檢測檢出率15.50‰。MLPA檢測盡管能快速檢測也不能完全替代金標準染色體核型分析技術(shù)檢測，二者結(jié)合檢測可以免去染色體核型分析技術(shù)檢測不成功之?dāng)_，MLPA檢測結(jié)果也經(jīng)染色體核型分析技術(shù)檢測驗證，提高染色體檢測準確率，對提高人口出生質(zhì)量有重要意義。

表1 羊水染色體核型異常結(jié)果

染色體核型分析檢測結(jié)果準確可靠，可檢測人類染色體倍數(shù)改變，也可以檢測染色體缺失、重組等結(jié)構(gòu)改變，是染色體產(chǎn)前診斷一項金標準檢測方法[5,6]，但染色體核型分析技術(shù)要細胞培養(yǎng)，檢測時間長，操作程序復(fù)雜，技術(shù)要求高，往往有檢測不成功案例。根據(jù)作者李金鴿等[7]報道，對西安地區(qū)72例流產(chǎn)絨毛組織染色體核型分析，培養(yǎng)未成功20例，培養(yǎng)未成功率為27.78%。根據(jù)作者黃和明等[8]報道，對286稽留流產(chǎn)患者絨毛組織的染色體核型分析，培養(yǎng)未成功24例，培養(yǎng)未成功率為8.39%。根據(jù)作者胡道琴等[9]報道，對116例稽留流產(chǎn)患者絨毛細胞染色體核型分析，培養(yǎng)未成功5例，培養(yǎng)未成功率為4.31%。根據(jù)作者雷冬竹等[10]報道，對湖南郴州地區(qū)106例自然流產(chǎn)絨毛細胞染色體核型分析，培養(yǎng)未成功4例，培養(yǎng)未成功率為3.77%。根據(jù)作者李艷華等[11]報道，對有產(chǎn)前診斷指征孕婦羊水650例進行染色體核型分析檢測,培養(yǎng)未成功16例，培養(yǎng)未成功率為2.17%。根據(jù)作者蔡美英等[12]報道，對960份胎兒臍帶血進行染色體核型分析檢測,有10份臍帶血培養(yǎng)未成功,未成功率為1.04%。

MLPA技術(shù)是一種針對靶核酸序列進行定性和定量分析技術(shù)，從DNA提取至檢測結(jié)果時間僅要1至2個工作日，一個反應(yīng)可對多達50個基因目標位點的重復(fù)、缺失、單核苷酸多態(tài)性等進行檢測[13，14]，其原理為基因捕獲+PCR+毛細管電泳分離，設(shè)備自動化程度高，設(shè)有質(zhì)控探針，可檢測實驗過程中出現(xiàn)問題，確保實驗結(jié)果準確性，同時可檢測幾十個樣本，具有快速、高通量的優(yōu)勢。

MLPA技術(shù)無法對染色體的結(jié)構(gòu)異常以及部分嵌合體、缺失、三倍體少見染色體的數(shù)目的變化檢測[15]，本研究采用MLPA技術(shù)檢測，檢測出異常染色體31例，而采用染色體核型分析檢測，檢測出異常染色體達62例，用MLPA技術(shù)少檢測50%異常染色體，故不能單獨用一種方法檢測。MLPA技術(shù)檢測，檢測標本細胞至少需要3000個，不能用于單細胞檢測，MLPA技術(shù)無法檢測染色體平衡易位，MLPA帶有的端粒特異性檢測探針可以檢測絕大部分的染色體不平衡易位[16]，當(dāng)有母體細胞污染可能會導(dǎo)致結(jié)果判斷錯誤。因此，快速MLPA檢測聯(lián)合染色體核型分析實現(xiàn)優(yōu)勢互補,提高產(chǎn)前胎兒染色體異常檢出率和準確率，為產(chǎn)婦提供準確的胎兒染色體信息，提高優(yōu)生指導(dǎo)服務(wù)，提高人口出生質(zhì)量，具有良好的臨床應(yīng)用價值。