急性缺血性腦卒中患者妊娠相關(guān)血漿蛋白A超敏檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)

曾昭偉，陳淑蓮，常艷敏，王學(xué)謙

(天津市南開醫(yī)院 檢驗(yàn)科，天津300100)

急性缺血性腦卒中(IS)是臨床上常見的心血管系統(tǒng)疾病之一，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后釋放炎性介質(zhì)并形成易損斑塊，導(dǎo)致血管病變，促進(jìn)IS進(jìn)展[1]。妊娠相關(guān)蛋白A(PAPP-A)是一種基質(zhì)金屬蛋白酶，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過程中起重要作用，是心血管系統(tǒng)炎性疾病的生物標(biāo)志物之一[2]。但在動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中的PAPP-A濃度極低[3]，普通ELISA方法難以檢測(cè)。由于IS是頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生不穩(wěn)定、破裂，引起血小板黏附、活化、聚集和血栓形成導(dǎo)致，所以推測(cè)PAPP-A是IS的潛在生物標(biāo)志物，已有少量相關(guān)研究[4]支持這一理論。本研究制備基于活性表位集中的特異PAPP-A重組抗原，建立基于微球、生物素標(biāo)記的PAPP-A與化學(xué)發(fā)光結(jié)合的超敏檢測(cè)方法，并對(duì)IS發(fā)生發(fā)展時(shí)PAPP-A檢測(cè)的臨床意義進(jìn)行初步評(píng)估。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1臨床資料 收集天津市南開醫(yī)院2017年6月至2018年6月收治確診的神經(jīng)內(nèi)科IS患者血清。包括輕度患者39例，男23例，女16例，平均年齡(56±11)歲；中度患者43例，男24例，女19例，平均年齡(65±9)歲，重度患者患者36例，男20例，女16例，平均年齡(52±12)歲。對(duì)照組40例，男27例，女13例，平均年齡(58±16)歲。診斷均經(jīng)CT/MRI檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝腎功能不全、嚴(yán)重的心力衰竭、心肌梗死、心源性腦栓塞、顱內(nèi)出血、近1個(gè)月內(nèi)有外傷史或手術(shù)史、腫瘤性疾病、急性感染性疾病、風(fēng)濕性疾病等。

1.1.2試劑與儀器 Lica research 化學(xué)發(fā)光分析儀(中國上海博陽生物技術(shù)有限公司)、96孔發(fā)光微孔板、受體微球及鏈霉素親和素包被供體球均購自美國Perkin Elmer公司。定值標(biāo)準(zhǔn)品由Perkin Elmer公司提供，PAPP-A標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0 mU/L、10 mU/L、40 mU/L、200 mU/L、800 mU/L、2 000 mU/L。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集 患者入院后清晨空腹時(shí)，靜脈取血4 ml，置真空采血管中，醫(yī)用低速離心機(jī)4 000 r/min 離心10 min，吸取血清檢測(cè)，其余分裝，保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2重組PAPP-A制備 利用DNAstar軟件分析PAPP-A的CDS區(qū)，選擇抗原性最強(qiáng)的抗原表位編碼區(qū)。以PAPP-A-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌種為模板制備DNA，PAPP-A的DNA和pET42a質(zhì)粒分別雙酶切，凝膠回收、連接，轉(zhuǎn)化Top10大腸埃希菌，篩選陽性克隆鑒定正確后，轉(zhuǎn)化BL21大腸埃希菌，誘導(dǎo)產(chǎn)生PAPP-A重組蛋白，鎳柱純化PAPP-A重組蛋白。

1.2.3PAPP-A抗體制備、純化 利用制備的重組PAPP-A注射家兔，制備對(duì)應(yīng)抗PAPP-A多克隆抗體。并用金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)親和層析法純化抗體。

1.2.4抗體標(biāo)記微球 離心管中加入0.1 mg包被抗體，6 000 r/min離心10 min，用PBS緩沖液洗滌，重復(fù)3次，加入0.5 mg受體微球及1.5 μl Tween-20，加PBS 緩沖液至100 μl，37 ℃振蕩孵育48 h。

1.2.5生物素標(biāo)記抗體 將抗PAPP-A抗體裝入MwCO為12 000的透析袋中，置0.1 mol/L的碳酸鹽溶液(pH 9.5)中充分透析，換液3次。將生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯(HOSU)溶于二甲基甲酰胺中，最終濃度20 mg/mL。將生物素與抗體混合，室溫下攪拌1 h?；旌弦涸?℃下用0.1 mol/L，pH 7.4的PBS溶液透析24 h。

1.2.6PAPP-A檢測(cè) 在96孔板中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品25 μl、1∶100稀釋標(biāo)有PAPP-A抗體微球30 μl、1∶2 000稀釋的生物素化抗體25 μl，37℃振動(dòng)孵育30 min；避光加入100 μl鏈霉素親和素包被供體球，37℃振動(dòng)孵育10 min，化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定信號(hào)值。

1.2.7方法學(xué)評(píng)價(jià) 靈敏度、特異度、回收率、準(zhǔn)確率、穩(wěn)定性等方法學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)均按照實(shí)驗(yàn)室成熟的方案進(jìn)行。

1.2.8與時(shí)間分辨免疫熒光法(TRFIA)檢測(cè)對(duì)比 隨機(jī)挑選確診的陽性病例70例檢測(cè)。時(shí)間分辨免疫熒光法按試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 重組抗原的純化及鑒定針對(duì)篩選的抗原決定簇集中表位，制備PAPP-A重組抗原，經(jīng)過鎳柱純化后，進(jìn)一步利用親和層析凝膠柱純化，1-4管PAPP-A活性較高，見圖1；經(jīng)western blot鑒定有明顯目的條帶，見圖2。

圖1 重組PAPP-A蛋白經(jīng)過免疫親和層析洗脫

圖2 重組PAPP-A蛋白經(jīng)過western blot鑒定

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線本研究建立的基于微球標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法以參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，檢測(cè)信號(hào)值為縱坐標(biāo)，由logistic曲線擬合(四參數(shù))處理得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性良好，見圖3。

圖3 PAPP-A標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1靈敏度 用標(biāo)準(zhǔn)曲線反算出0 mU/L OD值的±2s對(duì)應(yīng)的濃度值，得出該方法的靈敏度為0.30 mU/L。

2.3.2準(zhǔn)確度 回收實(shí)驗(yàn)證明回收率在96%以上，說明此方法具有很好的準(zhǔn)確性，見表1。

表1 不同濃度標(biāo)本的回收率測(cè)定

2.3.3穩(wěn)定性 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，在37℃溫箱中放置3 d與0 d穩(wěn)定性無明顯變化，5 d后標(biāo)準(zhǔn)品OD值均上升，但線性良好，說明試劑盒的穩(wěn)定性良好。但放置7 d后，最大OD值較高，且線性變差，見圖4。

圖4 0、3、5、7天PAPP-A穩(wěn)定性對(duì)比

2.4 方法測(cè)定結(jié)果的對(duì)比本文方法與精密度較高的時(shí)間分辨免疫熒光法[5]對(duì)比測(cè)定70例標(biāo)本，以TRFIA試劑盒所測(cè)得PAPP-A濃度為X軸，本文方法測(cè)定PAPP-A濃度為Y軸，繪制散點(diǎn)圖，見圖5。變量進(jìn)行相關(guān)性分析，r=0.982 (P<0.01)，說明兩種檢測(cè)方法相關(guān)性良好。

圖5 TRFIA試劑盒所測(cè)結(jié)果與本方法測(cè)定結(jié)果對(duì)比

2.5 各組血清PAPP-A水平比較IS各組PAPP-A 濃度較正常對(duì)照組升高，IS輕中重度組血漿PAPP-A 濃度比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01，見表2。

表2 IS輕中重度組、對(duì)照組PAPP-A 濃度比較

**P<0.01；a與對(duì)照組比較，b與輕度組比較，c與中度組比較，P<0.01

3 討論

IS發(fā)病迅猛、病死率高，其病程的主要變化是腦血管動(dòng)脈粥樣硬化、易損斑塊的形成及破裂，基質(zhì)金屬蛋白酶在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成并發(fā)展為不穩(wěn)定斑塊過程中起重要作用，早期檢測(cè)對(duì)降低易損斑塊、降低患病率、病死率有重要意義[6]。

PAPP-A屬于鋅離子依賴的基質(zhì)金屬蛋白酶，于1974年在孕婦血清中發(fā)現(xiàn)。PAPP-A在孕婦血清中是四聚體形式存在，但是在血管疾病斑塊形成中存在形式是同二聚體，且含量極低。迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的PAPP-A底物之一是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4(IGF binding protein-4,IGFBP-4 )。有報(bào)道表明，抑制某些非編碼RNA如miR-490-3p可靶向作用于PAPP-A，促進(jìn)水解IGFBP-4使IGF-1釋放[7,8]，IGF-1作用于血管平滑肌上的受體，促進(jìn)炎性介質(zhì)的釋放，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖遷移，間接促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展[9]，表明PAPP-A是心血管系統(tǒng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的重要上游基因。另外，PAPP-A作為金屬蛋白酶之一，與多種信號(hào)通路相關(guān)，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，導(dǎo)致粥樣硬化斑塊破裂[10]。臨床診斷方面，2015年，Wang[4]等研究證實(shí)PAPP-A是IS患者良好的診斷指標(biāo)。Wang[11]等研究發(fā)現(xiàn)PAPP-A 在IS患者表達(dá)顯著升高，PAPP-A可以作為預(yù)測(cè)IS患者臨床事件的預(yù)后指標(biāo)。

目前臨床用于檢測(cè)患者血清PAPP-A含量方法仍主要基于ELISA，在方法學(xué)上抗原抗體反應(yīng)的固有缺陷導(dǎo)致靈敏度不足。TRFIA靈敏度較高，本研究用來作為檢測(cè)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)。但TRFIA操作繁瑣，檢測(cè)昂貴，并非最優(yōu)方法。本研究試圖建立一種增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度及特異度的方法，增強(qiáng)PAPP-A臨床檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值。首先，因?yàn)镻APP-A會(huì)與proMBP形成四聚體[12]，這種基于四聚體形式的抗原制備的抗體，使檢測(cè)有非特異反應(yīng)，本研究挑選了PAPP-A的抗原優(yōu)勢(shì)表位，制備了表位特異的抗體應(yīng)用于后續(xù)的檢測(cè)，排除了proMBP抗原成分在其中引起的干擾。其次，由于PAPP-A含量低，ELISA檢測(cè)難以區(qū)分其余正常對(duì)照組的含量差別。本研究加樣后形成抗體包被發(fā)光顆粒-抗原-生物素化抗體的復(fù)合物，鏈霉素親和素包被的感光顆粒與之結(jié)合，適當(dāng)?shù)拈g距使感光顆粒在680 nm的激光照射下，促進(jìn)周圍的氧分子激發(fā)，形成單線態(tài)氧，可引起發(fā)光顆粒發(fā)射熒光信號(hào)，單光子計(jì)數(shù)器可捕獲熒光信號(hào)，并根據(jù)信號(hào)值大小計(jì)算待測(cè)物的濃度。本研究利用化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度，結(jié)合微球標(biāo)記抗體增大反應(yīng)面積以及生物素親和素的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)可以有效檢測(cè)出PAPP-A信號(hào)值，在IS各組及正常對(duì)照組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見PAPP-A與IS患者疾病分層有密切關(guān)聯(lián)，可以作為高效準(zhǔn)確的判定指標(biāo)應(yīng)用于臨床檢測(cè)IS患者[13]。

本研究建立的方法有效避免了其他表位及proMBP的非特異干擾，從根本上解決了非特異反應(yīng)的問題，并且生物素親和素系統(tǒng)的參與以及受體微球及供體微球增大了反應(yīng)面積，均使此反應(yīng)體系有極高的靈敏度。本檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，適合于推廣。我們計(jì)劃后續(xù)擴(kuò)大樣本量，深入研究IS發(fā)病初期及病情在進(jìn)展中不同階段PAPP-A濃度的變化，以便早期明確診斷IS患者，并嚴(yán)密監(jiān)控疾病進(jìn)展及預(yù)后，使PAPP-A的臨床應(yīng)用更廣泛。