定量分析幽門(mén)螺桿菌根除前后部分腸道菌群的改變*

唐源淋 陳 燁

深圳市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科1(518114) 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化科 廣東省胃腸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2

背景：全球約半數(shù)人群存在幽門(mén)螺桿菌(Hp)感染，根除Hp是治療其感染相關(guān)疾病的重要方法。目的：分析Hp根除前后部分腸道菌群的改變，探討鉍劑四聯(lián)療法對(duì)腸道微生態(tài)的影響。方法：納入2016年1月—2017年1月在深圳市第三人民醫(yī)院發(fā)現(xiàn)Hp感染陽(yáng)性、接受鉍劑四聯(lián)療法根除治療并成功根除Hp的個(gè)體，采集其Hp根除前和根除治療結(jié)束后3 d內(nèi)的糞便標(biāo)本，提取基因組DNA，采用菌屬特異性引物行real-time PCR定量分析。結(jié)果：與根除前相比，Hp根除后糞便腸桿菌屬、腸球菌屬數(shù)量明顯增加，雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬和總菌數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，乳酸桿菌屬數(shù)量無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)論：采用鉍劑四聯(lián)療法根除Hp可影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡。

幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)感染與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的關(guān)系已得到公認(rèn)[1]。全球約半數(shù)人群存在Hp感染，根除Hp是治療其感染相關(guān)疾病的重要方法。目前國(guó)、內(nèi)外Hp感染處理共識(shí)均推薦使用由質(zhì)子泵抑制劑(PPI)、鉍劑聯(lián)合兩種抗菌藥物組成的四聯(lián)方案根除Hp[2-3]。既往研究發(fā)現(xiàn)Hp感染對(duì)胃內(nèi)正常菌群結(jié)構(gòu)有顯著影響[4]，關(guān)于Hp根除治療對(duì)腸道微生態(tài)的影響，現(xiàn)有研究結(jié)果不一。本研究通過(guò)分析Hp根除前后部分腸道菌群的改變，探討鉍劑四聯(lián)療法對(duì)腸道微生態(tài)的影響。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

納入2016年1月—2017年1月在深圳市第三人民醫(yī)院體檢中心發(fā)現(xiàn)Hp感染陽(yáng)性、首次接受Hp根除治療并成功根除Hp的個(gè)體，采集其Hp根除前后的糞便標(biāo)本進(jìn)行定量分析。采集體檢中心同期健康體檢者的糞便標(biāo)本用于引物特異性檢測(cè)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①入組前14C-尿素呼氣試驗(yàn)(14C-UBT)結(jié)果陽(yáng)性(DOB≥100)，治療結(jié)束后4周復(fù)查14C-UBT結(jié)果陰性(DOB<100)；②既往未接受過(guò)Hp根除治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心、腦、肺、腎等器官功能不全；②合并慢性腹瀉、炎癥性腸病等已知可引起腸道菌群紊亂的疾病；③胃腸道手術(shù)史；④進(jìn)入試驗(yàn)前4周應(yīng)用PPI、抗菌藥物和(或)微生態(tài)制劑。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

1. Hp根除治療：采用鉍劑四聯(lián)療法行Hp根除治療：艾司奧美拉唑鎂腸溶片20 mg口服，2次/d+膠體果膠鉍膠囊200 mg口服，2次/d+阿莫西林膠囊1 000 mg口服，2次/d+克拉霉素緩釋片0.5 g口服，2次/d，療程14 d。根除治療過(guò)程中記錄藥物相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生情況。治療結(jié)束后4周復(fù)查14C-UBT。

2. 糞便標(biāo)本采集：Hp根除前和根除治療結(jié)束后3 d內(nèi)，于排便后2 h內(nèi)收集糞便標(biāo)本并儲(chǔ)存于密閉儲(chǔ)存盒內(nèi)，迅速置入-80 ℃低溫冰箱中保存。

3. 糞便基因組提?。好坷S便樣本稱取200 mg，使用TIANamp糞便DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取基因組DNA，-20 ℃保存。

4. PCR引物設(shè)計(jì)：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)腸桿菌屬、腸球菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬的菌屬特異性引物[5-6]和總菌引物[7]，并在BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)內(nèi)比對(duì)引物序列的特異性(表1)。

5. PCR引物特異性檢測(cè)：提取健康體檢者糞便基因組DNA，行常規(guī)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積25 μL：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(溫度見(jiàn)表1)，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示電泳圖中除目的條帶外未見(jiàn)明顯非特異性擴(kuò)增，提示引物特異性好，可用于real-time PCR。

6. Real-time PCR：試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)10倍稀釋，獲得10～107系列拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，以之為模板構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系總體積20 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，退火20 s(溫度分別為腸桿菌屬58 ℃，腸球菌屬52 ℃，雙歧桿菌屬57 ℃，乳酸桿菌屬58 ℃，擬桿菌屬60 ℃，梭菌屬60 ℃，總菌60 ℃)，72 ℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析。將待測(cè)糞便DNA適當(dāng)稀釋后，反應(yīng)體系和條件同上，行real-time PCR。檢測(cè)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以M(P25,P75)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR菌屬特異性引物和總菌通用引物信息

結(jié) 果

一、一般情況

共50例成功根除Hp并符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的患者納入研究，其中男性30例，女性20例，平均年齡(30±10)歲。根除治療過(guò)程中5例(10.0%)患者出現(xiàn)惡心，7例(14.0%)出現(xiàn)腹脹，15例(30.0%)出現(xiàn)腹瀉，5例(10.0%)出現(xiàn)便秘，少數(shù)患者同時(shí)有上述2～3項(xiàng)癥狀。

二、Hp根除前后主要腸道菌群改變

Real-time PCR檢測(cè)顯示，與根除前相比，Hp根除后糞便腸桿菌屬、腸球菌屬數(shù)量明顯增加，雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，乳酸桿菌屬數(shù)量無(wú)明顯變化(P>0.05)，總菌數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；表2、圖1)。

討 論

Hp于1983年首次從胃黏膜中被成功分離，其可在強(qiáng)酸性環(huán)境下穩(wěn)定定植，通過(guò)產(chǎn)生CagA、VacA等細(xì)胞毒素以及代謝產(chǎn)物的直接破壞作用和介導(dǎo)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致胃黏膜持續(xù)性損害，與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃MALT淋巴瘤的發(fā)病密切相關(guān)。隨著對(duì)Hp研究的日益深入，越來(lái)越多的胃腸外疾病，如特發(fā)性血小板減少性紫癜、不明原因缺鐵性貧血等亦被發(fā)現(xiàn)與Hp感染相關(guān)[2-3]。我國(guó)人群Hp感染率在50%以上，根除Hp是治療其感染相關(guān)疾病的重要方法，可修復(fù)胃黏膜，促進(jìn)潰瘍愈合，降低潰瘍復(fù)發(fā)和胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)、內(nèi)外Hp感染處理共識(shí)均推薦使用由PPI、鉍劑聯(lián)合兩種抗菌藥物組成的四聯(lián)療法根除Hp，療程為10 d或14 d[2-3]。

表2 Hp根除前后主要腸道菌群改變(M, lg copies/g糞便)

腸道內(nèi)細(xì)菌是一個(gè)巨大的微生態(tài)平衡系統(tǒng)，其平衡依賴于各種菌群種類、數(shù)量、定居部位等多方面的平衡，菌群之間相互協(xié)調(diào)、相互制約，共同構(gòu)成整體平衡的微生態(tài)系統(tǒng)。既往研究顯示，抗菌藥物的不當(dāng)使用可引起腸道菌群失調(diào)，影響程度取決于藥物的抗菌譜及其劑量、給藥途徑、使用時(shí)間、腸道內(nèi)藥物濃度等[8-11]。Barc等[12]應(yīng)用含人類糞便中主要菌群的小鼠模型研究阿莫西林克拉維酸對(duì)腸道微生態(tài)的影響，結(jié)果顯示用藥后腸桿菌屬和普氏菌屬數(shù)量顯著增加，優(yōu)桿菌屬和梭菌屬數(shù)量顯著減少。另一項(xiàng)應(yīng)用高通量技術(shù)分析抗菌藥物對(duì)成人腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的研究[10]顯示，大劑量抗菌藥物可顯著改變擬桿菌、雙歧桿菌、梭菌、腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量，不同抗菌藥物對(duì)不同菌種的影響各不相同。且抗菌藥物的濫用或不規(guī)范使用可選擇并富集耐藥菌株[13-15]，耐藥菌大量繁殖導(dǎo)致菌群比例發(fā)生變化，造成腸道微生態(tài)失衡。因此，規(guī)范、合理地使用抗菌藥物具有重要意義。

圖1 Hp根除前后主要腸道菌群改變(real-time PCR)

鉍劑四聯(lián)療法Hp根除治療方案中含有兩種抗菌藥物，藥物劑量大，療程較長(zhǎng)，治療過(guò)程中部分患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的惡心、嘔吐、腹脹、腹瀉、便秘、食欲不振等一系列胃腸道功能紊亂癥狀，推測(cè)根除Hp造成的胃腸道微生態(tài)環(huán)境變化可能參與了這些癥狀的發(fā)生。當(dāng)前日益升高的Hp根除失敗率以及多重耐藥的出現(xiàn)是否與根除治療所致的繼發(fā)性菌群失調(diào)存在關(guān)聯(lián)，亦有待明確。目前Hp根除治療藥物對(duì)腸道微生態(tài)的影響正逐步受到廣泛關(guān)注。本研究選取6個(gè)具有代表性的腸道菌群，通過(guò)定量分析其在鉍劑四聯(lián)療法根除Hp前后的改變，探討根除治療對(duì)腸道菌群的影響，以期為益生菌在Hp根除治療中的應(yīng)用提供臨床依據(jù)。

本組50例行鉍劑四聯(lián)療法根除治療的Hp陽(yáng)性患者中，分別有5例、7例、15例和5例出現(xiàn)惡心、腹脹、腹瀉、便秘等胃腸道功能紊亂癥狀。與根除前相比，Hp根除后糞便腸桿菌屬、腸球菌屬數(shù)量顯著增加，雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬和總菌數(shù)量顯著減少，乳酸桿菌屬數(shù)量則無(wú)明顯變化，證實(shí)Hp根除治療會(huì)對(duì)部分腸道菌群產(chǎn)生影響，導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡。國(guó)內(nèi)學(xué)者既往采用細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)的研究結(jié)果亦顯示Hp根除治療對(duì)腸道菌群有顯著影響[16-17]。傳統(tǒng)的糞便細(xì)菌培養(yǎng)方法存在費(fèi)時(shí)、培養(yǎng)要求高、影響因素多等問(wèn)題，real-time PCR、宏基因組測(cè)序技術(shù)能較完整地保留腸道微生物的遺傳信息，結(jié)果更接近菌群的真實(shí)概況，在研究菌群中微生物特定基因的功能、代謝通路等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。但宏基因組測(cè)序也存在對(duì)測(cè)序片段進(jìn)行分裝的計(jì)算量大、參考數(shù)據(jù)庫(kù)不完善、算法的準(zhǔn)確性對(duì)后續(xù)菌群分析影響大、測(cè)序深度不夠時(shí)對(duì)稀有物種的敏感性不高、費(fèi)用昂貴、操作復(fù)雜等不足，難以廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)。Real-time PCR則克服了宏基因組測(cè)序特征維度高、對(duì)稀有物種不敏感、生物學(xué)背景弱等缺點(diǎn)，方法簡(jiǎn)單、易操作，敏感性和特異性高，適合在臨床實(shí)踐中開(kāi)展。

Hp根除治療相關(guān)胃腸道微生態(tài)失衡可能導(dǎo)致細(xì)菌移位、細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)和腸源性感染，從而影響患者預(yù)后，因此針對(duì)菌群失調(diào)的治療顯得尤為重要。峗向東[18]的研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌活菌制劑能有效防治Hp根除治療引起的腸道菌群失調(diào)。除抗菌藥物外，Hp根除治療方案中的PPI亦對(duì)胃腸道微生態(tài)有顯著影響。肖麗君[19]的研究表明，Hp根除治療可顯著升高胃內(nèi)pH值，使機(jī)體抵御外源性病原體的天然屏障受損，導(dǎo)致胃內(nèi)細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)；聯(lián)合使用雙歧桿菌三聯(lián)活菌制劑則可減少根除治療相關(guān)的胃內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)，胃液pH值大于4時(shí)該作用尤為明顯。有研究[20]發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)期使用PPI的人群中，21%存在小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)(SIBO)。對(duì)于單純SIBO病例，使用益生菌制劑即可能達(dá)到腸道去污和癥狀緩解[21]，慢性SIBO患者則應(yīng)考慮抗菌藥物利福昔明治療[22-23]。國(guó)內(nèi)賀星等[24]的研究探討了利福昔明與雙歧桿菌三聯(lián)活菌制劑序貫治療SIBO的效果，結(jié)果顯示與單純利福昔明治療相比，序貫治療可顯著提高小腸細(xì)菌轉(zhuǎn)陰率和臨床療效。楊娟等[25]采用利福昔明聯(lián)合酪酸梭菌制劑治療SIBO，亦取得良好效果。近年來(lái)，越來(lái)越多的臨床研究驗(yàn)證了在傳統(tǒng)三聯(lián)或四聯(lián)療法基礎(chǔ)上加用乳酸桿菌或布拉酵母菌可提高Hp根除率，因此歐洲最新Maastricht Ⅴ共識(shí)報(bào)告建議基于已顯示的臨床效果選擇特定益生菌作為Hp根除治療的輔助用藥[2]。

綜上所述，我國(guó)人群Hp感染率高，陽(yáng)性患者應(yīng)接受Hp根除治療。國(guó)、內(nèi)外共識(shí)推薦的鉍劑四聯(lián)療法可影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為腸桿菌屬、腸球菌屬數(shù)量增加，雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬和總菌數(shù)量減少，導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡。然而本研究只采集了Hp根除后單一時(shí)間點(diǎn)的糞便標(biāo)本，故未能進(jìn)一步明確腸道菌群結(jié)構(gòu)隨時(shí)間推移的變化，對(duì)于不同Hp根除治療方案對(duì)腸道微生態(tài)是否具有不同影響，亦缺乏足夠的臨床證據(jù)，有待后續(xù)研究進(jìn)一步完善。目前益生菌在消化系統(tǒng)中的作用機(jī)制及其生物學(xué)特性和行為尚未完全明確，在臨床應(yīng)用方面亦存在諸多問(wèn)題，如益生菌菌株的選擇、治療劑量和療程以及如何與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用等，有待未來(lái)進(jìn)一步深入研究。