細(xì)菌表達(dá)dsRNA介導(dǎo)桔小實(shí)蠅flightin基因的RNA干擾

袁瑞玲，鄭傳偉，馮 丹，王藝璇，杜春花，陳 鵬

（1.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院, 云南 昆明 650201；3.興義市林業(yè)局，貴州 興義 562400）

【研究意義】RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種廣泛存在于真核生物中高度保守的、由dsRNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解，使相應(yīng)基因不能表達(dá)，從而引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默的現(xiàn)象［1-3］。dsRNA 導(dǎo)入生物體內(nèi)后，被細(xì)胞中稱為Dicer 的RNase Ⅲ分解成21～23 bp的小干擾RNA（siRNA），siRNA 在沉默復(fù)合體（RISC）的作用下與目標(biāo)mRNA 結(jié)合，序列特異性地降解靶mRNA，阻止相應(yīng)蛋白產(chǎn)物的合成，導(dǎo)致靶標(biāo)基因的功能喪失?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】RNAi技術(shù)已被廣泛應(yīng)用在基因功能研究、高通量靶標(biāo)基因篩選、基因治療、藥物靶標(biāo)預(yù)測(cè)等領(lǐng)域，對(duì)多種農(nóng)林害中的成功試驗(yàn)，也證實(shí)了利用RNAi進(jìn)行害蟲防治的可能性和廣泛性［4-5］。RNAi 技術(shù)在害蟲防治領(lǐng)域的應(yīng)用需要大劑量dsRNA，目前最常用的試劑盒合成方法價(jià)格昂貴、不能持續(xù)生產(chǎn)。利用轉(zhuǎn)基因寄主植物表達(dá)昆蟲源dsRNA對(duì)害蟲有一定防效，但植物轉(zhuǎn)基因難度高、研究周期長，具有很大的局限性。用細(xì)菌（如大腸桿菌）表達(dá)dsRNA的方法操作簡(jiǎn)單，具有成本低且表達(dá)產(chǎn)物量大等特點(diǎn)，是基因工程四大表達(dá)系統(tǒng)之一［6］。飼喂或注射細(xì)菌表達(dá)的dsRNA 能顯著干擾甜菜夜蛾［7］、非洲甘薯象鼻蟲［8］等害蟲的生長，證明該技術(shù)在植物保護(hù)方面的應(yīng)用潛力。桔小實(shí)蠅［（Bactrocera dorsalis（Hendal）］，又名東方果實(shí)蠅（oriental fruit fly），屬雙翅目（Diptera）實(shí)蠅科（Trypetidea）、果實(shí)蠅屬（Bactrocera），是我國二類進(jìn)境檢疫性害蟲［9-11］，超強(qiáng)的飛行能力使得對(duì)桔小實(shí)蠅的防治變得困難［12-13］。目前對(duì)該害蟲的防治手段主要有人工防治、化學(xué)防治及性誘劑的生物防治等，這些手段具有一定的防治效果，但總體存在效率低、成本高、對(duì)生態(tài)環(huán)境不友好的問題。因此RNA 干擾這種靶標(biāo)性強(qiáng)、環(huán)境友好型的技術(shù)在害蟲防控領(lǐng)域展現(xiàn)出較大的應(yīng)用潛力。

【本研究切入點(diǎn)】飛行蛋白flightin是一種大小在20 ku的多磷酸化肌原纖維蛋白，最早是在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）間接飛行肌中被發(fā)現(xiàn)［14］。flightin對(duì)昆蟲肌肉伸展活化具有重要作用，在間接飛行肌的粗肌絲上與肌球蛋白高度融合，調(diào)控和指導(dǎo)粗肌絲的準(zhǔn)確組裝和收縮等［14］。選擇飛行蛋白flightin基因作為RNA干擾靶標(biāo)，破壞昆蟲飛行肌表達(dá)通路，阻止昆蟲肌肉伸展活化及肌絲的組裝和收縮等生理過程，可達(dá)到害蟲防治的目的?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以L4440 質(zhì)粒為載體，構(gòu)建了利用大腸桿菌HT115 表達(dá)桔小實(shí)蠅flightin-dsRNA的體系，通過對(duì)桔小實(shí)蠅新羽化成蟲飼喂細(xì)菌表達(dá)的dsRNA，檢測(cè)該方法介導(dǎo)的RNAi 在桔小實(shí)蠅中的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試?yán)ハx 供試蟲源為云南省林業(yè)科學(xué)院森保所室內(nèi)飼養(yǎng)的桔小實(shí)蠅種群。飼養(yǎng)條件為：溫度25～30 ℃，濕度60%～70%，光周期L16∶D8。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒載體 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司，大腸桿菌HT115（DE3）購自北京華越洋生物科技有限公司，L4440 質(zhì)粒購自美國 Addgene 機(jī)構(gòu)，含egfp基因的質(zhì)粒由西南林業(yè)大學(xué)徐進(jìn)研究員惠贈(zèng)。

1.1.3 酶及有關(guān)試劑 總RNA提取試劑盒Trizol-A+、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR PremixEx Taq實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，TSINGKE Master Mix DNA Polymerase購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，T4 DNA 連接酶、DNase I、RNaseA、限制性內(nèi)切酶SacI、XhoI購自thermofisher公司，氨芐青霉素（Amp）、X-gal、IPTG購自Amresco公司，鹽酸四環(huán)素（Tet）購自solarbio公司，DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司，異丙醇、氯仿、無水乙醇等其他分析純?cè)噭┵徸岳猜〔┤A（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司，引物合成及測(cè)序委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 桔小實(shí)蠅總RNA的提取按照Trizol- A+試劑盒說明書進(jìn)行。FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，20℃保存?zhèn)溆?，以此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn) PCR模板。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)桔小實(shí)蠅flightin基因轉(zhuǎn)錄組序列（GenBank登錄號(hào)：XM_011210668），用siDirect（http://design.RNAi.jp/）在線預(yù)測(cè)可能存在的 siRNA 位點(diǎn)，選擇其中 678 bp 序列作為RNA 干擾片段。用Primer5.0和Oligo6，結(jié)合含有T7聚合酶的L4440干擾載體的多克隆位點(diǎn)以及桔小實(shí)蠅flightin基因和egfp序列的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)設(shè)計(jì)上游和下游引物。上、下游引物的5'端分別加入SacI和XhoI酶切位點(diǎn)。

1.2.3 桔小實(shí)蠅flightin基因及對(duì)照egfp基因片段的克隆 分別以桔小實(shí)蠅cDNA和含egfp基因的質(zhì)粒為模板，按照TSINGKE Master Mix DNA Polymerase說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆桔小實(shí)蠅flightin及egfp基因干擾片段。PCR擴(kuò)增體系：TSINGKE Master Mix DNA Polymerase 12.5 μL，上、下游引物和模板各1 μL，加滅菌ddH2O至總體積25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用l%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并用DNA回收試劑盒純化回收目的片段送測(cè)序。

1.2.4 桔小實(shí)蠅flightin及egfp基因的RNA干擾表達(dá)載體構(gòu)建 將L4440質(zhì)粒與膠回收的桔小實(shí)蠅flightin和egfp基因片段分別同時(shí)用SacI和XhoI進(jìn)行雙酶切，37 ℃，1 h，分別回收酶切產(chǎn)物。用T4連接酶將回收的L4440載體分別與flightin、egfp基因片段以1∶3比例室溫連接10 min。連接產(chǎn)物命名為L4440-flightin、L4440-egfp，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布在含Amp、IPTG、Xgal的固體LB平板培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液PCR檢測(cè)陽性后，提取重組質(zhì)粒L4440-flightin和L4440-egfp，用SacI和XhoI雙酶切鑒定，篩選陽性克隆，取陽性克隆菌液送測(cè)序。

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HT115 用熱激法將L4440-flightin和L4440-egfp表達(dá)載體轉(zhuǎn)入CaCl2法制備的HT115感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含50 μg/mL Amp和12.5 μg/mL Tet的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種到Amp和Tet抗性的LB液體培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒并通過PCR及雙酶切鑒定陽性克隆，重組質(zhì)粒進(jìn)一步通過測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.6 dsRNA在大腸桿菌HT115中的表達(dá) 將帶有L4440-flightin和L4440-egfp的HT115菌液接種于Amp和Tet抗性LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，1∶25比例將菌液轉(zhuǎn)入新的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至菌液OD600=0.4左右，加入IPTG終濃度至1.0 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后收集菌液。采用TRIzol法提取細(xì)菌總RNA，DNase I和RNase A溶液消化純化總RNA，獲得flightin-dsRNA和egfp-dsRNA。

1.2.7 飼喂細(xì)菌表達(dá)dsRNA的菌液后桔小實(shí)蠅flightin基因的RNA干擾 從桔小實(shí)蠅羽化開始飼喂IPTG誘導(dǎo)表達(dá)靶標(biāo)dsRNA的大腸桿菌HT115的 10倍濃縮菌液，處理組（飼喂flightindsRNA菌液）和對(duì)照組（飼喂egfp-dsRNA菌液）各3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)200頭蟲（雌雄比1∶1）。將濃縮菌液拌進(jìn)成蟲飼料，每天更換一次新鮮飼料，連續(xù)飼喂25 d，處理組和對(duì)照組雌、雄蟲分開。

RT-qPCR檢測(cè)RNAi效果：采集1、5、10、15、20日齡蟲樣品，3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)各取50頭蟲，分別提取總RNA。熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)RNAi后flightin基因的表達(dá)情況，采用2-△△Ct方法計(jì)算靶標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。flightin和egfp基因及16S內(nèi)參基因的qPCR引物如下:

通過飛行能力測(cè)試檢測(cè)RNAi效果：經(jīng)過持續(xù)飼喂后，分別在5、10、15、20日齡利用佳多飛行磨系統(tǒng)進(jìn)行雌、雄蟲飛行能力測(cè)試，參照袁瑞玲等［15］的方法。

整蟲與胸部組織質(zhì)量測(cè)定：隨機(jī)選取待測(cè)桔小實(shí)蠅各20頭，使用乙醚輕微麻醉后迅速稱量整蟲質(zhì)量，然后迅速在解剖鏡下去除翅、足、頭、腹等組織，僅留下胸部肌肉組織快速稱量其質(zhì)量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 桔小實(shí)蠅flightin及對(duì)照egfp基因干擾片段的克隆

PCR擴(kuò)增得到含SacI和XhoI酶切位點(diǎn)的桔小實(shí)蠅flightin和egfp基因片段，結(jié)果為，桔小實(shí)蠅flightin基因片段介于500～750 bp之間，對(duì)照egfp基因片段介于100～250 bp之間分別與預(yù)期添加了酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基后的大小692 bp和201 bp相符（圖1 A 3、4泳道）。測(cè)序結(jié)果與GenBank報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)，無堿基差異，同源性達(dá)100%，桔小實(shí)蠅flightin基因及egfp基因干擾片段克隆成功。

把載體質(zhì)粒L4440和膠回收得到的目的片段分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacI和XhoI雙酶切后，2 790 bp的L4440質(zhì)粒線性化單一條帶約2 755 bp，桔小實(shí)蠅flightin及對(duì)照egfp基因大小正確（圖1 A 2、5、6泳道）。

2.2 dsRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

圖1 flightin和egfp基因干擾片段的克隆及干擾載體的構(gòu)建Fig.1 Cloning of RNAi fragment of flightin and egfp and construction of RNAi vector

HT115菌株中提取的重組質(zhì)粒L4440-flightin和L4440-egfp（圖1 B）經(jīng)SacI和XhoI雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳20 min檢測(cè)均分別得到兩條帶，2 755 bp的線性化L4440質(zhì)粒載體，及678 bp和187 bp左右的flightin和egfp目的片段（圖1 C），表明桔小實(shí)蠅flightin基因和對(duì)照egfp基因片段成功轉(zhuǎn)入L4440質(zhì)粒中，與預(yù)期設(shè)計(jì)一致。雙向測(cè)序結(jié)果與目的基因序列完全一致，閱讀框正確，說明已經(jīng)成功構(gòu)建了L4440-flightin和L4440-egfp干擾表達(dá)載體。

2.3 飼喂表達(dá)目的dsRNA菌液后flightin表達(dá)水平

通過連續(xù)飼喂表達(dá)flightin-dsRNA和egfpdsRNA的菌液后，處理組與對(duì)照組相比，在雌、雄蟲中均未產(chǎn)生預(yù)期的下調(diào)效果，反而出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)現(xiàn)象。雌蟲在飼喂后1、5、10、15、20 d時(shí)全部產(chǎn)生上調(diào)，與對(duì)照相比分別上調(diào)1.15、2.70、2.27、1.02、3.50倍，其中，飼喂后5、10、20 d與對(duì)照差異顯著，飼喂后1、15 d與對(duì)照無顯著差異。雄蟲飼喂后15 d誘發(fā)約43%的下調(diào)，而在飼喂后1、5、10、20 d分別誘發(fā)1.38、2.77、1.57、2.98倍的上調(diào)，其中飼喂后5日齡與對(duì)照差異顯著，其余差異不顯著。結(jié)果表明，雌、雄蟲均在飼喂后5 d誘發(fā)的上調(diào)幅度最大。

2.4 飼喂表達(dá)flightin-dsRNA菌液后對(duì)飛行能力的影響

連續(xù)飼喂表達(dá)flightin-dsRNA和egfp-dsRNA的菌液后，5、10、15、20、25日齡的雌、雄蟲飛行能力測(cè)試結(jié)果（圖3）顯示，在飛行距離上各日齡處理組與對(duì)照組差異不明顯。結(jié)果表明，飼喂表達(dá)flightin-dsRNA的大腸桿菌菌液對(duì)桔小實(shí)蠅進(jìn)行RNA干擾，對(duì)其飛行能力沒有明顯影響。

圖2 熒光定量PCR分析桔小實(shí)蠅flightin基因表達(dá)水平Fig.2 Expression level of flightin from Bactrocera dorsalis by real-time quantitative PCR

圖3 飼喂表達(dá)dsRNA菌液后桔小實(shí)蠅飛行距離Fig.3 Flight distance of Bactrocera dorsalis after feeding bacterial expressing dsRNAs

2.5 飼喂表達(dá)flightin-dsRNA菌液后胸部組織與整蟲鮮重比

根據(jù)桔小實(shí)蠅飼喂菌液進(jìn)行RNAi后flightin基因的表達(dá)量測(cè)定結(jié)果，選取上調(diào)幅度較大的5日齡雌、雄蟲稱量其整蟲與胸部組織的鮮重，得到胸部與整蟲的鮮重比。結(jié)果顯示，處理組雌、雄蟲鮮重比分別為34.64%和36.53%，與對(duì)照組雌、雄蟲鮮重比的34.39%和35.99%沒有差異，認(rèn)為飼喂菌液進(jìn)行RNAi對(duì)胸部肌肉發(fā)育無影響。

3 討論

諸多研究報(bào)道，利用大腸桿菌HT115（DE3）工程菌表達(dá)dsRNA是經(jīng)濟(jì)、高產(chǎn)的方法。早在1998年，Timmons等［16］就開始利用HT115表達(dá)的dsRNA喂食線蟲，結(jié)果靶標(biāo)基因的表達(dá)受到抑制。RNaseIII是細(xì)菌中普遍存在的dsRNA 特異性核酸內(nèi)切酶，由rnc基因編碼，HT115 菌株為rnc-突變不能降解自身合成的dsRNA。HT115經(jīng)過修飾，插入一個(gè)λDE3噬菌體衍生物，可通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)T7 RNA聚合酶。HT115的四環(huán)素和Amp抗性，可在培養(yǎng)過程中分別排除rnc+反突變體和空載質(zhì)粒。L4440載體序列的多克隆位點(diǎn)兩側(cè)各有1個(gè)相反方向的T7 聚合酶啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)入HT115 菌株后，可經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)dsRNA。

隨著細(xì)菌表達(dá)dsRNA技術(shù)的不斷成熟，該技術(shù)在包括桔小實(shí)蠅在內(nèi)的多種昆蟲研究中得以實(shí)現(xiàn)，有效沉默了目的基因表達(dá)［6-7,17-20］。在玉米上噴施表達(dá)菌液可抑制花葉病毒的感染［21］，在桔小實(shí)蠅精子形成相關(guān)基因lola、topi、rac、rho、upd和magu研究中，飼喂表達(dá)dsRNA的大腸桿菌干擾后，成功降低了基因表達(dá)水平并導(dǎo)致精子質(zhì)量和數(shù)量的下降，產(chǎn)卵量及孵化率受干擾而降低［22］。利用該質(zhì)粒構(gòu)建的重組質(zhì)粒可以在大腸桿菌HT115（DE3）中表達(dá)大量所需的外源目的dsRNA，在RNAi研究中，該方法比利用試劑盒體外轉(zhuǎn)錄和化學(xué)合成，能夠大大降低實(shí)驗(yàn)成本，而且通過誘導(dǎo)表達(dá)目的dsRNA飼喂昆蟲達(dá)到RNAi的操作相對(duì)簡(jiǎn)單易行［6,18］。然而，直接飼喂也存在一些問題，Li等［6］直接喂食桔小實(shí)蠅Noa、Rab11、V-ATP-D和Rpl19基因表達(dá)dsRNA的大腸桿菌后，成功降低了基因的表達(dá)水平，但部分出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象。Liu等［23］研究表明，桔小實(shí)蠅成蟲長期飼喂dsRNA或表達(dá)dsRNA的大腸桿菌菌液，靶標(biāo)基因均會(huì)出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象，導(dǎo)致該現(xiàn)象的機(jī)制尚不明確。在其他昆蟲中不能成功干擾靶標(biāo)基因的例子也鮮有報(bào)道，如黑腹果蠅飼喂表達(dá)dsRNA的酵母未能沉默靶標(biāo)基因表達(dá)，對(duì)果蠅3種亞種飼喂RNAi體系同樣未實(shí)現(xiàn)目的基因的沉默等［24-25］。

本研究結(jié)果表明，桔小實(shí)蠅飼喂表達(dá)flightin基因dsRNA的大腸桿菌未造成預(yù)期的目的基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)，也未造成飛行能力的減弱或影響發(fā)育等，分析認(rèn)為，未能成功沉默靶標(biāo)基因的原因可能有：飼喂法對(duì)于桔小實(shí)蠅存在對(duì)RNAi的非基因特異性免疫耐受機(jī)制，有關(guān)桔小實(shí)蠅RNAi免疫耐受研究發(fā)現(xiàn)，dsRNA攝取由胞吞機(jī)制調(diào)控，其間會(huì)受到阻遏而無法進(jìn)入細(xì)胞［26］；飼喂表達(dá)dsRNA大腸桿菌后導(dǎo)致靶標(biāo)基因上調(diào)，存在應(yīng)激機(jī)制及抗性可能是造成這一現(xiàn)象的原因之一［27-28］，很多刺激源（包括大腸桿菌）會(huì)激發(fā)桔小實(shí)蠅siRNA通路；Zambon等［29］發(fā)現(xiàn)果蠅在抗病毒過程中，出現(xiàn)基因表達(dá)上調(diào)，結(jié)果證實(shí)病毒激發(fā)了IMD、Toll-way和Jak-STAT的信號(hào)通路；不同物種中腸環(huán)境差異導(dǎo)致RNAi效率也不盡相同；攝取dsRNA劑量不合適，飼喂法由昆蟲自主取食，無法保證其攝取量而影響RNAi效率，也無法確定引發(fā)RNAi的dsRNA劑量；桔小實(shí)蠅flightin基因在飼喂后1日齡時(shí)表達(dá)最高，成蟲開始飼喂RNAi基本已經(jīng)過了該基因表達(dá)高峰，飼喂法錯(cuò)過最佳干擾時(shí)間；有研究表明基于飼喂法的RNAi效率普遍低于注射法［30］，本課題組已通過體外轉(zhuǎn)錄合成flightin-dsRNA注射桔小實(shí)蠅，成功下調(diào)了flightin基因的表達(dá)，降低了成蟲的飛行能力（待發(fā)表）；也有大量研究表明dsRNA介導(dǎo)的RNAi在雙翅目中具有效率不高和持效性差等諸多問題［28］。

4 結(jié)論

采用RT-PCR技術(shù)克隆桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis（Hendel）flightin基因片段，并以此為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)有效的干擾片段，以線蟲RNAi干擾載體L4440為載體，成功構(gòu)建了桔小實(shí)蠅flightin基因RNAi載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌HT115（DE3）菌株，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)flightin基因?qū)?yīng)的dsRNA。通過飼喂表達(dá)flightin-dsRNA的大腸桿菌，桔小實(shí)蠅flightin基因的表達(dá)出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)；該方法對(duì)桔小實(shí)蠅飛行能力及胸部肌肉發(fā)育未產(chǎn)生明顯的影響。未能成功沉默flightin靶標(biāo)基因的具體原因有待后續(xù)研究進(jìn)一步探明，利用飼喂表達(dá)flightin基因dsRNA的大腸桿菌方法對(duì)桔小實(shí)蠅flightin基因進(jìn)行RNA干擾的可行性還需進(jìn)一步確認(rèn)。