三葉草作為Sr、Cs污染指示植物的效應研究

陳 敏，王 丹，閔可憐，湛曉蝶，劉 玲

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621000；2.西南科技大學核廢物與環(huán)境安全國防重點實驗室，四川 綿陽 621000）

【研究意義】核素90Sr、137Cs是核裂變反應的主要放射性產(chǎn)物，核試驗、核事故和核武器的使用等導致核素90Sr、137Cs大量釋放到環(huán)境中，大氣中的放射性核素污染物隨降水進入土壤環(huán)境［1］。90Sr、137Cs半衰期較長，進入環(huán)境很難清除，容易通過食物鏈進入人體，對人體產(chǎn)生危害［2］。目前對土壤核素污染的監(jiān)測方法主要是取樣檢測法［3］，這種監(jiān)測方式工作量大，監(jiān)測成本高且不具有長期性和連續(xù)性。在實際應用中多采用生物監(jiān)測與理化監(jiān)測相結合的方式，可以真實有效全面反映污染對環(huán)境的危害。早在1987年我國就開始了生物監(jiān)測工作，在水體、土壤、大氣等領域開展生物監(jiān)測并取得了多方面的應用成果［4］。隨著我國加大對核資源的開發(fā)利用，造成核廢棄物、廢渣的產(chǎn)生，無疑增加了環(huán)境放射性污染的可能性［5-6］。因此，做好核素污染監(jiān)測和防治是一項勢在必行的工作，具有一定的前瞻性。

【前人研究進展】當環(huán)境發(fā)生改變時，生物針對環(huán)境變化做出適應性改變，植物對不同脅迫產(chǎn)生的特征反應，對環(huán)境有直接或間接的指示作用。核素和重金屬等脅迫在植物個體水平、細胞水平、分子水平各級產(chǎn)生影響［7-9］；對植物的營養(yǎng)生長有抑制作用，使植物外觀表現(xiàn)出病態(tài)特征［10］；對植物的生殖生長產(chǎn)生影響，影響植物開花結果等［11-14］。研究Sr、Cs對植物生長發(fā)育的影響，以期從眾多植物中尋找到敏感植物，為土壤核素Sr、Cs污染的生物監(jiān)測打下良好基礎。

【本研究切入點】目前已有大量關于生物監(jiān)測的研究報道，主要在大氣和水體污染方面取得了良好效果。由于土壤環(huán)境的復雜情況，鮮有針對土壤核素Sr、Cs污染，利用高等植物作為指示植物的研究。有研究發(fā)現(xiàn)，三葉草對大氣污染敏感［15］，有作為敏感植物的特征。同時，在植物修復領域，豆科植物對重金屬污染更為敏感，三葉草是豆科植物中很受歡迎的研究材料，對重金屬具有較強的轉運能力［16-17］。其生長快速，用途廣泛，常被用作草坪綠植，牧草、綠肥等，具有很大的實際應用價值?！緮M解決的關鍵問題】本研究選取豆科植物三葉草作為試驗材料，參照前人研究設置極低處理濃度，在環(huán)境條件更單一的水培環(huán)境中，分別研究Sr、Cs和Sr+Cs處理對植物生長和生理生化的影響，對以高等植物作為土壤污染指示植物進行初探。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物為三葉草（Trifolium pratenseL.），種子購于江蘇省宿遷市輝煌花木院。供試試劑SrCl2·6H2O和CsCl購于綿陽市信捷商貿有限責任公司。

1.2 試驗方法

試驗于2018年10月26日至2019年1月在西南科技大學溫室進行。三葉草種子在育苗盆中用河沙∶珍珠巖=3∶1基質育苗，待植株生長到4片真葉時進行移栽。試驗采取盆栽水培方法，每盆（長43.5 cm×寬20 cm×高14 cm）加入Hogland營養(yǎng)液5 L（營養(yǎng)液參照張曉雪等［18］的方法進行配制，用1 mol/L NaOH溶液調制pH 6.0）。純營養(yǎng)液培養(yǎng)7 d，待三葉草適應水培環(huán)境后，更換營養(yǎng)液并一次性添加SrCl2·6H2O和CsCl溶液。試驗設3種處理，每種處理設置4個水平，分別為0.1、0.5、1、2 mg/L，Sr處理分別表示為Sr 0.1、Sr 0.5、Sr 1.0、Sr 2.0，Cs處理分別表示為Cs 0.1、Cs 0.5、Cs 1.0、Cs 2.0，Sr+Cs（1∶1）處理分別表示為（Sr+Cs）0.1、（Sr+Cs）0.5、（Sr+Cs）1.0、（Sr+Cs）2.0，以只含營養(yǎng)液的空白處理作對照（CK）。每個處理3次重復，每個重復1盆，共39盆，每盆定植10株，共390株。每隔1 d向盆中打入等量空氣，補充氧氣，同時觀察記錄三葉草生長情況。每隔10 d向盆中補充營養(yǎng)液，保證三葉草正常生長。

1.3 測定指標及方法

盆栽培養(yǎng)45 d統(tǒng)計三葉草植株冠徑、葉面積、單株黃葉率等生長指標。培養(yǎng)50 d，每盆收獲8株三葉草，剪取植物葉片鮮樣保存測定相關生理生化指標。用電子天平稱量鮮重后烘干至恒重稱取干重。

1.3.1 三葉草生理生化指標測定 用硫代巴比妥酸（TBA）加熱比色法［19］測定植物葉片丙二醛（MDA）含量，用95%乙醇浸提比色法［20］測定葉片葉綠素含量；在整個培養(yǎng)過程中，每隔1 d觀察記錄1次三葉草生長狀況，在試驗處理后50 d統(tǒng)計各項生長指標。

1.3.2 植株Sr、Cs含量測定 將植物烘干樣品研磨成粉末，稱取0.5 g，加入10 mL硝酸（分析純）、5 mL高氯酸（分析純）于消解爐上消解至透明，然后每30 min趕酸1次，待酸霧趕盡冷卻后定容至10 mL，采用火焰原子吸收光譜法［21］測定樣品Sr、Cs含量。

試驗數(shù)據(jù)采用采用Microsoft Excel 2007和SPSS 25.0軟件進行處理和單因素方差分析及多重比較。圖表采用Origin 9.0繪制。

2 結果與分析

2.1 Sr、Cs、Sr+Cs處理對三葉草生長的影響

2.1.1 不同處理對三葉草各生長指標的影響 由表1可知，Sr處理對三葉草單株葉面積有顯著促進作用，且隨處理濃度的升高呈下降趨勢，其中Sr0.1處理的葉面積比對照高8.6%，其余生長指標與對照無顯著差異。Cs處理對三葉草植株冠徑、單株葉面積、地上部鮮重均有顯著抑制作用，表現(xiàn)為Cs0.1、Cs0.5、Cs1.0、Cs2.0處理植株冠徑比對照分別低35.0%、25.0%、34.9%、28.0%，單株葉面積比對照分別低31.6%、32.4%、38.2%、41.7%，地上部鮮重比對照分別低46.2%、42.7%、41.7%、48.0%； Cs2.0處理三葉草地部鮮重顯著低于對照33.8%，其余Cs處理三葉草地下部鮮重與對照無顯著差異，說明較低濃度Cs處理對三葉草地下部生長影響不大。Sr+Cs處理三葉草各項生長指標均顯著低于對照，表現(xiàn)為（Sr+Cs）0.1、（Sr+Cs）0.5、（Sr+Cs）1.0、（Sr+Cs）2.0處理植株冠徑比對照分別低31.6%、37.1%、29.5%、34.8%，單株葉面積比對照分別低16.8%、17.4%、19.4%、21.1%，地上部鮮重比對照分別低47%、51.6%、52.4%、59.9%，地下部鮮重比對照分別低26.2%、41.6%、43.9%、47.8%，表明Sr+Cs復合處理對三葉草地下部生長抑制作用更強。

表1 Sr、Cs和Sr+Cs不同處理對三葉草各生長指標的影響Table 1 Effects of Sr, Cs and Sr+Cs treatments on the growth indicators of clover

2.1.2 不同處理三葉草葉片黃化表現(xiàn) 三葉草經(jīng)Sr、Cs和Sr+Cs處理后的前15 d生長緩慢，未觀察到黃化葉片。處理后17 d，首先在Cs 2.0處理發(fā)現(xiàn)三葉草葉片表現(xiàn)異常（圖1 A），少數(shù)葉片出現(xiàn)邊緣黃化；在之后的觀察中發(fā)現(xiàn)，Cs處理和Sr+Cs處理的三葉草葉片陸續(xù)出現(xiàn)此現(xiàn)象，圖1B～D為葉片黃化過程，葉片黃化從邊緣開始，逐漸向葉片中心蔓延，最終整個葉片黃化壞死。從整株來看，葉片黃化從植株底部老葉開始向生長點發(fā)展，嚴重的植株出現(xiàn)大量葉片黃化，但沒有植株徹底死亡。處理后45 d統(tǒng)計的三葉草單株黃葉率如圖2所示，可以看出Sr處理各濃度間三葉草單株黃葉率與對照無顯著差異；Cs和Sr+Cs處理下三葉草單株黃葉率隨處理濃度升高而逐漸上升，最高分別為38.2%、39.9%，在濃度大于0.5 mg/L時Sr+Cs處理下黃葉率大于Cs處理，說明當Sr、Cs復合處理對三葉草生長影響更大。

圖1 三葉草生長過程中葉片黃化表現(xiàn)Fig.1 Leaf yellowing performance in the growth of clover

圖2 三葉草單株黃葉率Fig.2 Yellow leaf rate of per plant of clover

2.1.3 不同處理對三葉草生物量的影響 植物生物量變化可以直接表明重金屬對植物生長的影響。如圖3所示，比較3種處理三葉草地上部干質量的大小關系可知，Sr處理下，僅Sr2.0處理地上部干質量顯著低于對照；Cs處理和Sr+Cs處理下，地上部干質量均顯著低于對照，以Cs2.0和（Sr+Cs）1.0處理的干質量最低，比對照分別低48%和56%。比較3種處理三葉草地下部干質量的大小關系可知，僅Sr+Cs處理的地下部干質量顯著低于對照，以（Sr+Cs）1.0處理的干質量最低，比對照低44%。綜上所述，Sr+Cs處理對三葉草的抑制作用最顯著，其次為Cs處理，Sr處理對三葉草生長的影響較小。

圖3 三葉草植株地上部、地下部生物量Fig.3 Average shoot and root biomass of per plant of clover

2.2 Sr、Cs和Sr+Cs處理對三葉草生理生化的影響

2.2.1 不同處理對三葉草葉片MDA含量的影響 MDA是植物膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量間接反映植物膜脂過氧化程度和植物所受的逆境脅迫。由圖4可知，三葉草葉片MDA含量在3種處理下均隨處理濃度升高而逐漸增加，其中Sr處理濃度1.0 mg/L、Cs 處理濃度0.5 mg/L、Sr+Cs處理濃度1.0 mg/L時，三葉草葉片MDA含量顯著高于對照，說明三葉草葉片MDA含量對Cs處理濃度更敏感；Cs 2.0處理三葉草葉片MDA含量最高達35.06 nmol/g，為對照的2.06倍，而（Sr+Cs）0.1處理下三葉草葉片MDA含量低于對照，隨后逐漸升高且顯著高于對照。綜上所述，三葉草葉片膜脂過氧化程度隨處理濃度升高而逐漸加重。

圖4 三葉草葉片MDA含量比較Fig.4 Comparison of MDA contents in leaves of clover

2.2.2 不同處理對三葉草葉片葉綠素含量的影響 植物葉綠素含量直接影響植物光合作用，與植物營養(yǎng)生長和葉片黃化密切相關。由圖5可知，Sr處理三葉草葉片葉綠素含量隨處理濃度升高逐漸降低，與對照差異不顯著；Cs 0.1、Cs 0.5、Cs 2.0處理三葉草葉片葉綠素總含量顯著低于對照，比對照分別低40%、53%、43%；（Sr+Cs）0.1、（Sr+Cs）1.0處理葉片葉綠素總含量顯著低于對照，比對照分別低32%、35%。綜上結果表明，Cs處理和Sr+Cs處理三葉草葉片葉綠素合成受到顯著抑制，植株形態(tài)發(fā)生明顯變化，葉面積減小，葉片黃化數(shù)量增多。

圖5 三葉草葉片葉綠素總含量比較Fig.5 Comparison of chlorophyll contents in leaves of clover

2.3 三葉草植株對Sr、Cs吸收情況比較

由圖6A可知，三葉草地上部和地下部Sr含量均隨Sr處理濃度的升高而顯著升高，其地上部Sr含量在0.49～1.89 mg/kg之間，地下部Sr含量在0.31～1.13 mg/kg之間，在Sr處理濃度2.0 mg/L時植株Sr含量達到最高，且表現(xiàn)為地上部＞地下部，表明三葉草對Sr有一定的轉運能力。由圖6 B可知，三葉草地上部和地下部Cs含量均隨Cs處理濃度的升高而顯著升高，其地上部Cs含量在1.80～14.54 mg/kg之間，地下部Cs含量在1.65～11.25 mg/kg之間，在Cs處理濃度2.0 mg/L時植株Cs含量達到最高。在單一Cs處理濃度超過0.1 mg/kg時，三葉草地上部Cs含量高于地下部；Sr+Cs處理三葉草地上部Cs含量高于地下部，說明三葉草對Cs具有較強的轉運能力。比較圖6A與圖6B，在同一濃度Sr+Cs處理下，三葉草對Cs有更強的積累能力，其地上部和地下部Cs含量遠遠大于Sr含量。綜上所述，三葉草對Sr的積累量較低，對三葉草生長的影響較小，對Cs積累量較高，使三葉草生長受到影響，且表現(xiàn)出受脅迫特征。

3 討論

對土壤Sr、Cs污染的研究主要針對植物修復方面，研究者往往重點關注植物對Sr和Cs耐受性、生物量大小、吸收能力以及轉運能力等，以期篩選出超富集植物。本研究中，參照前人［18,22-23］研究的基礎，設置了比以往研究更低的濃度，表現(xiàn)出Cs處理比Sr處理對三葉草生長抑制作用更大。唐永金等［24］研究在高濃度Sr、Cs（500 mg/kg）處理下，Sr處理植物生長更好。有研究表明，低濃度Sr處理對植物生長有促進作用，高濃度Sr抑制植物生長［25］。本研究中，Sr處理對三葉草生長無顯著影響，但其單株葉面積顯著增加，可能是由于三葉草對Sr的吸收量較小且三葉草對Sr不敏感，因此與對照無顯著差異。洪曉曦等［26］研究發(fā)現(xiàn)，低濃度Cs處理對油菜生長發(fā)育有促進作用，而高濃度Cs處理油菜生長受到抑制，株高、生物量、葉綠素含量、POD活性都呈下降趨勢。本研究中，添加Cs的處理濃度較低，但Cs處理和Sr+Cs處理對三葉草的生長具有抑制作用，表現(xiàn)為植株冠徑、單株葉面積、植株鮮重和葉綠素含量等均顯著低于對照，表明三葉草對Cs處理較為敏感。

本研究結果表明，三葉草葉片MDA含量隨3種處理濃度的升高呈顯著上升的趨勢，與安冰等［22］、儲玲等［27］的研究結果一致。這表明Sr處理對三葉草的影響首先表現(xiàn)在生理水平，其生長表現(xiàn)與對照無顯著差異，可能原因是三葉草對Sr的吸收量還不足以打破三葉草生理平衡以及三葉草對Sr、Cs的響應程度不同。在Cs處理和Sr+Cs處理下，三葉草無論是在生理水平和個體水平均表現(xiàn)出脅迫反應，進一步表明三葉草對Cs的敏感性。有研究表明，重金屬脅迫會影響植物葉綠素的合成，進而影響植物光合作用合成有機物，使植物生長受到抑制，表現(xiàn)出黃葉現(xiàn)象［28］。本研究中，Sr處理三葉草的生長與對照無顯著差異，且其葉片葉綠素含量與對照亦無顯著差異，這與多數(shù)低Sr促進葉綠素形成的研究結果存在差異［29］，其原因可能為不同植株對Sr的抗逆性存在明顯差異。然而，Cs處理和Sr+Cs處理，三葉草葉片明顯黃化，且葉片葉綠素含量顯著低于對照，這與武慧斌［30］研究中Cs處理紅三葉草葉綠素含量降低的結果一致。

不同植物對Sr、Cs的吸收能力不同，有的植物對Cs的吸收能力大于對Sr的吸收能力［18,31］，有的植物則相反［23］，但均表現(xiàn)為植物體內Sr、Cs含量隨處理濃度的升高而升高［22,24,32］。本研究3種處理下三葉草對Cs的吸收能力均強于對Sr的吸收能力，兩種元素的含量均隨處理濃度的升高而逐漸升高。有研究報道，Sr和Ca具有相似化學性質，Ca的存在會降低植物對Sr的吸收［33］，試驗所用營養(yǎng)液Ca離子豐富，這可能是三葉草對Sr吸收量較小的原因。三葉草地上部Cs含量也大于其地下部，Hampton等［34］、White等［35］、Qi等［36］報道的Cs毒性機理表明，植物對K和Cs的吸收依賴同一載體，二者具有競爭關系。楊俊誠等［37］研究表明，在Cs污染的土壤中施加K可有效減少植株對Cs的吸收。此外，植物在缺少K元素時葉片也會表現(xiàn)出葉緣呈黃色或赤褐色焦枯［38］，還會表現(xiàn)出葉綠素含量下降和葉面積減小等特征［39］。本研究中，Cs處理和Sr+Cs處理三葉草葉片黃化特征明顯，從葉片邊緣黃化至整個葉片，此現(xiàn)象與植物缺鉀癥狀極為相似，且三葉草對Cs有較強的吸收和轉運能力。這可能是由于Cs存在時，Cs元素競爭性占用了K元素的轉運蛋白，抑制了三葉草對K元素的吸收，最終導致三葉草葉片出現(xiàn)缺鉀癥狀。研究表明，Sr和Cs相互影響、相互抑制植物對Sr和Cs的吸收［40］，當Sr、Cs復合處理后，植物對Sr、Cs的積累量均小于單一Sr、Cs處理，這與本研究結果一致。由于水培環(huán)境與土壤環(huán)境存在很大差異，水培結果不能完全代表土壤污染情況，需進一步進行土培驗證，探究三葉草對Cs的敏感性，并且在之后的研究中應注意Sr與Ca、Cs與K元素之間的相互影響，進一步探究植物對Sr、Cs的敏感機理。

4 結論

本試驗結果表明，Sr、Cs和Sr+Cs處理三葉草生長情況存在差異，其中Sr處理對三葉草生長無顯著影響，而Cs處理和Sr+Cs處理對三葉草產(chǎn)生了一定程度的毒害作用，導致三葉草葉綠素含量顯著降低，葉面積減小，生物量降低，葉片黃化，膜脂過氧化程度加重，表明三葉草對Cs較為敏感，具有作為Cs污染土壤指示植物的潛力。Cs處理三葉草個體水平表現(xiàn)出特異性特征，即三葉草葉片邊緣出現(xiàn)褐色斑點，在葉片邊緣形成一圈黃色干枯，并逐漸向葉片中心發(fā)展，直至整個葉片黃化干枯，此現(xiàn)象可能成為三葉草對Cs污染土壤的指示特征。