基于表型和SSR標(biāo)記的金平草果遺傳多樣性分析

馬孟莉 王田濤 雷 恩 孟衡玲 張 薇 張婷婷 盧丙越

（紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，661100，云南蒙自）

草果（Amomum tsao-koCrevost et Lemaire）是姜科豆蔻屬（AmomumL.）多年生草本植物，全珠具有辛辣味，其果實(shí)是一種常用的中藥，具有清濕化痰和溫脾祛寒的功效，草果也是主要的調(diào)味品之一[1-2]。草果主要分布于我國(guó)云南、廣西、貴州以及越南北部等地區(qū)，是熱帶、亞熱帶森林中一種重要的經(jīng)濟(jì)作物[3]。云南省是草果的主產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)量和種植面積約占中國(guó)的95%。據(jù)2016年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，云南省草果種植面積22.93萬(wàn)hm2，其中紅河州6.93萬(wàn)hm2。紅河州金平縣因種植面積大且草果質(zhì)量好，被稱為“草果之鄉(xiāng)”，種植歷史有400余年[4]。

遺傳多樣性的研究對(duì)草果資源的保護(hù)和利用具有重要意義。表型性狀具有易于識(shí)別和掌握、簡(jiǎn)單直觀和快速等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性研究[5-8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)因其不受環(huán)境及發(fā)育階段影響而被廣泛用于遺傳多樣性研究。SSR分子標(biāo)記具有重現(xiàn)性好、共顯性、分布范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。從表型性狀和分子水平兩方面共同分析植物的遺傳多樣性，對(duì)其種質(zhì)資源的利用與保護(hù)具有十分重要的意義。

作為中藥和調(diào)味品的草果，之前的研究主要集中在精油提取、化學(xué)成分分析和藥理作用等方面[9-11]，而關(guān)于草果種質(zhì)資源遺傳多樣性方面的研究報(bào)道較少，限制了草果優(yōu)異種質(zhì)篩選及育種利用。近年來(lái)，隨著人們對(duì)草果資源鑒定及保護(hù)意識(shí)的加強(qiáng)，關(guān)于草果遺傳多樣性方面的研究逐漸增多。Zhang等[12]對(duì)云南省9個(gè)產(chǎn)區(qū)草果果實(shí)性狀進(jìn)行表型分析，結(jié)果表明，果實(shí)脊數(shù)、單果種子數(shù)和果實(shí)垂直直徑的變異最大。謝正萬(wàn)等[13]利用12個(gè)草果單株對(duì)適用于草果遺傳多樣性分析的RAPD引物進(jìn)行了篩選；Yang等[14]利用9對(duì)SSR標(biāo)記初步分析了云南3個(gè)居群的60個(gè)草果樣品的遺傳多樣性；胡一凡等[15]利用7對(duì)SSR引物對(duì)云南草果的遺傳多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)分析，結(jié)果表明，云南草果的遺傳多樣性水平較高，其中來(lái)自金平的JP1（10個(gè)樣本）和JP2（10個(gè)樣本）兩個(gè)居群各項(xiàng)多樣性參數(shù)均最高，遺傳多樣性最為豐富，這與金平縣作為“草果之鄉(xiāng)”，栽培草果歷史悠久，是國(guó)內(nèi)草果原產(chǎn)地之一的報(bào)道相符[4]。鑒于前人研究樣本數(shù)量偏少且未對(duì)金平地區(qū)的草果進(jìn)行表型分析，本研究利用13個(gè)表型性狀和5對(duì)SSR分子標(biāo)記對(duì)云南省草果主產(chǎn)區(qū)紅河州金平縣44份草果樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為草果資源的保存和可持續(xù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與表型測(cè)定

試驗(yàn)于2016年在紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院進(jìn)行。44個(gè)樣本隨機(jī)從2015年采自云南省金平縣阿得博鄉(xiāng)草果山（22°54′36″N，103°13′12″E）的152份草果樣本中選取。根據(jù)前期實(shí)地調(diào)研，采樣地草果種植歷史悠久，種植面積大，類型豐富。因此，為保證樣本的代表性，將植株形態(tài)、果實(shí)性狀等作為參考依據(jù)，且樣本之間的直線距離不小于50m，所有樣本經(jīng)紅河學(xué)院云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的張薇副教授鑒定為姜科豆蔻屬植物草果，標(biāo)本存放于紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院。每個(gè)樣本隨機(jī)選擇3個(gè)果穗，統(tǒng)計(jì)每個(gè)果穗上的小花數(shù)及掛果數(shù)，計(jì)算掛果率（每穗掛果數(shù)/每穗小花數(shù)）。每個(gè)樣本隨機(jī)選取10個(gè)果子用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量鮮果長(zhǎng)、鮮果寬，用萬(wàn)分之一天平稱量鮮果重，3次重復(fù)；果實(shí)置于100℃恒溫烘箱中烘至恒重，每個(gè)樣本選取10個(gè)干果分別用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量干果長(zhǎng)、干果寬，用萬(wàn)分之一天平稱量干果重、干果皮重和種子團(tuán)重，并統(tǒng)計(jì)單果種子數(shù)，3次重復(fù)。在采樣同時(shí)，收集每個(gè)樣本幼嫩的葉片，置于含有硅膠的5mL離心管中，用于后續(xù)DNA的提取。

1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用CTAB法提取草果基因組DNA，并用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量，將不同草果樣本基因組DNA稀釋至20ng/μ L的工作溶液，并保存于4℃冰箱中備用。

5對(duì)SSR引物序列選自Yang等[14]的研究結(jié)果，引物序列見(jiàn)表1。10 μ L聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）體系包含：1.0 μ L 模板 DNA（20ng/μ L）、0.8 μ L SSR 引物（0.2 μ mol/L）、0.8 μ L dNTPs（2.5mol/L）、1.2 μ L 10×PCR 緩沖液（含 Mg2+）、0.2 μ LTaqDNA 聚合酶（2.5U/μ L）、6 μ L ddH2O，反應(yīng)體系所用試劑均購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。所有擴(kuò)增均在PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min；95℃ 30s，55℃～59℃ 30s，72℃ 30s，共 30 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=19∶1）上分離，電泳結(jié)束后用1% AgNO3染色，待條帶清晰后拍照保存。

表1 SSR引物信息表Table 1 List of SSR markers used

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016統(tǒng)計(jì)各性狀數(shù)據(jù)，計(jì)算各性狀的最小值、最大值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異幅度和變異系數(shù)等基本統(tǒng)計(jì)參數(shù)。采用Shannon-Weaver多樣性指數(shù)（H′）評(píng)價(jià)各性狀的遺傳多樣性，H′=-Σ(Pi)(lnPi)，Pi表示第i種變異類型出現(xiàn)的頻率。利用SPSS 19.0軟件對(duì)草果表型性狀進(jìn)行主成分分析。

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，選擇重復(fù)性好、譜帶清晰的SSR標(biāo)記記錄。在相同遷移位置上有條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”，缺失用“—”表示。利用最終獲得的數(shù)據(jù)矩陣，用POPGENE 1.32軟件包計(jì)算多態(tài)帶百分比（PPB），觀測(cè)等位基因數(shù)（Na），有效等位基因數(shù)（Ne），觀測(cè)雜合度（Ho），期望雜合度（He）和 Shannon′s信息指數(shù)（I）。使用PowerMarker V3.25計(jì)算多態(tài)性信息含量（PIC）。參考Prevost等[16]的方法計(jì)算每對(duì)引物的解析度（Rp）：Rp=ΣIb，其中條帶信息Ib=1-（2×|0.5-p|），p指44個(gè)樣本中含有該片段的頻率。利用NTSYS-2.10e軟件中的SIMQUAL模塊計(jì)算樣本之間的遺傳相似性系數(shù)，采用非加權(quán)平均數(shù)法（UPGMA）進(jìn)行樣本聚類分析，獲得樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草果表型多樣性分析

在13個(gè)數(shù)量性狀中，掛果率、每穗花數(shù)、種子團(tuán)重、干果長(zhǎng)寬比和干果重的變異系數(shù)均在20.00%以上，其中掛果率的變異系數(shù)最大，變異系數(shù)為50.00%。鮮果寬的變異系數(shù)最小，為7.64%。13個(gè)性狀的H′為1.74～2.16，其中鮮果長(zhǎng)（2.16）、干果長(zhǎng)寬比（2.07）、每穗花數(shù)（2.04）、單果種子數(shù)（2.03）、干果寬（2.01）和果皮重（2.00）的H′均在2.00以上，這些性狀表型多樣性水平較高（表2）。進(jìn)一步通過(guò)主成分分析對(duì)13個(gè)性狀進(jìn)行降維，提取的前4個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到81.615%（表3）。第1主成分貢獻(xiàn)率為37.369%，主要為干果皮重、鮮果重、干果重、單果種子數(shù)、鮮果寬和干果寬等性狀，其特征向量絕對(duì)值都在0.700以上，主要反映草果質(zhì)量，與產(chǎn)量密切相關(guān)；第2主成分解釋了總變異的25.049%，主要貢獻(xiàn)來(lái)自干果長(zhǎng)寬比、鮮果長(zhǎng)寬比、干果長(zhǎng)和鮮果長(zhǎng)，這些性狀與果實(shí)的形狀有關(guān)，故第2主成分為果型因子；第3主成分和第4主成分的貢獻(xiàn)率分別為12.152%和7.046%，第3主成分的貢獻(xiàn)主要來(lái)自每穗花數(shù)，第4主成分的貢獻(xiàn)則主要來(lái)自掛果率。

表2 草果數(shù)量性狀多樣性分析Table 2 Diversity analysis of quantitative traits of Amomum tsao-ko

表3 基于表型性狀的草果主成分分析Table 3 Principal component analysis based on phenotypic traits of Amomum tsao-ko

2.2 草果SSR多樣性分析

5對(duì)SSR引物在44個(gè)草果樣本中共擴(kuò)增出23個(gè)條帶，多態(tài)帶百分比為100%。其中AT29和AT30擴(kuò)增條帶數(shù)最多，AT56最少，平均每對(duì)引物可以擴(kuò)增出4.6個(gè)多態(tài)性條帶。所檢測(cè)樣本的Ne介于 1.646～4.418，平均為 3.410；Ho介于 0.150～0.731，平均為 0.491；He介于 0.398～0.789，平均為 0.679；I最高為 1.581，最低為 0.582；PIC 為 0.405～0.763，平均為0.672。這些參數(shù)說(shuō)明金平草果具有較高的遺傳多樣性水平，其中AT29引物的解析度最大，對(duì)不同草果樣本的區(qū)分能力最強(qiáng)（表4）。

表4 草果SSR引物多態(tài)性分析Table 4 Polymorphism analysis of Amomum tsao-ko with SSR primers

2.3 基于SSR標(biāo)記的聚類分析

基于SSR標(biāo)記的草果樣本間的遺傳相似系數(shù)介于0.273～0.929。UPGMA聚類分析顯示，在相似性系數(shù)0.60處可將44個(gè)樣本分為2大類。類群I包括34個(gè)樣本，類群II包括10個(gè)樣本。以相似性系數(shù)0.619為閾值，類群I可進(jìn)一步分為2個(gè)亞群，亞群IA由26個(gè)樣本組成，亞群IB由8個(gè)樣本組成，亞群IB又可分為2組（IB1和IB2）。以遺傳相似系數(shù)0.662為閾值時(shí)，IA亞群可分為IA1（22個(gè)樣本）和IA2（4個(gè)樣本）2組，以遺傳相似系數(shù)0.681為閾值時(shí)，IA1又進(jìn)一步分為IA1a（11個(gè)樣本）和IA1b（11個(gè)樣本）2個(gè)亞組。類群II在相似性系數(shù)0.670處可分為2個(gè)亞群IIA和IIB。在IA1a中，J1、J7和J8以及J10和J23具有較高的相似性，IA1b亞組中的J15和J35也具有較高的遺傳相似性（圖1）。

3 討論

圖1 基于SSR標(biāo)記的44份草果樣本的聚類圖Fig.1 Cluster diagram of 44 Amomum tsao-ko individuals based SSR markers

所調(diào)查的草果表型中鮮果長(zhǎng)和干果長(zhǎng)寬比的H′最高，這2個(gè)性狀與草果果實(shí)形狀密切相關(guān)，說(shuō)明草果在果實(shí)形狀上具有豐富的類型，雷恩等[17]依據(jù)草果的果實(shí)形狀和揮發(fā)氣味將草果栽培種分為圓紅辛辣型、圓黃蘋果型、橢紅辛辣型和梭紅辛辣型，可見(jiàn)草果果實(shí)形狀可作為區(qū)分不同草果類型的重要依據(jù)。在13個(gè)被測(cè)性狀中掛果率的變異系數(shù)最大，為50.00%，表明草果掛果率在個(gè)體間差異明顯，是影響產(chǎn)量穩(wěn)定的重要因素，雷恩等[18]研究草果產(chǎn)量構(gòu)成時(shí)也發(fā)現(xiàn)增加草果掛果率對(duì)穩(wěn)定和提高草果植株產(chǎn)量具有重要的意義。主成分分析提取的前4個(gè)主成分可反映13個(gè)性狀的大部分信息，貢獻(xiàn)率分別占到37.369%、25.049%、12.152%和7.046%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)81.615%。在第1主成分中干果皮重、鮮果重、干果重、單果種子數(shù)、鮮果寬和干果寬等性狀荷載值最高，且性狀之間呈正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明果實(shí)寬、單果種子數(shù)多的類型果實(shí)重量較大；第2主成分中干果長(zhǎng)寬比、鮮果長(zhǎng)寬比、干果長(zhǎng)和鮮果長(zhǎng)貢獻(xiàn)最大，屬于果型因子，該主成分中種子團(tuán)重和干果重與干果寬等性狀呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明長(zhǎng)果型草果果重偏低。掛果率是決定產(chǎn)量最重要的因素，但該性狀與果實(shí)重、果實(shí)長(zhǎng)和果實(shí)直徑等與產(chǎn)量密切相關(guān)的性狀呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，在草果高產(chǎn)品種選育及栽培上要協(xié)調(diào)好這些性狀之間的關(guān)系，通過(guò)優(yōu)化各產(chǎn)量構(gòu)成因素指標(biāo)達(dá)到增產(chǎn)的目的。此外，草果精油及其成分是評(píng)價(jià)草果品質(zhì)的重要方面，研究產(chǎn)量構(gòu)成和精油含量及其成分之間的關(guān)系對(duì)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)草果種質(zhì)（品種）的選育具有重要意義，是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

本研究利用5對(duì)SSR引物對(duì)金平草果種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，這些樣本具有較高的遺傳多樣性，Na=4.6、Ho=0.491和He=0.679，高于Yang等[14]利用SSR標(biāo)記分析保山居群（Na=2、Ho=0.339、He=0.456）、法斗居群（Na=2、Ho=0.372、He=0.444）和馬關(guān)居群（Na=2、Ho=0.250、He=0.432）的各項(xiàng)參數(shù)。胡一凡等[15]利用SSR標(biāo)記分析云南不同產(chǎn)地草果遺傳多樣性得出，金平居群草果的遺傳多樣性水平最高，其中JP1 居群的Na、Ne、Ho、He和H(I)分 別 為 2.143、1.753、0.368、0.395和 0.603；JP2居群的分別為2.143、1.817、0.297、0.431和0.648，2個(gè)居群的各項(xiàng)遺傳參數(shù)均低于本研究的結(jié)果，這與金平悠久的草果栽培歷史，是我國(guó)草果原產(chǎn)地之一情況相一致。在本研究中，根據(jù)相似系數(shù)，44個(gè)草果樣品被分為2個(gè)類群。類群Ⅰ為主類群，由34個(gè)草果樣本組成，下面又由多個(gè)亞群組成，進(jìn)一步說(shuō)明金平草果類型豐富，多樣性水平較高。

根據(jù)前人及本研究的結(jié)果可以判斷金平縣是我國(guó)草果的原產(chǎn)地。近年來(lái)，由于草果病蟲害嚴(yán)重、加之草果栽培管理粗獷、產(chǎn)量易受環(huán)境條件影響等原因，導(dǎo)致部分農(nóng)民放棄種植草果，嚴(yán)重威脅到草果遺傳多樣性的維持。鑒于金平草果豐富的多樣性，系統(tǒng)收集金平范圍內(nèi)的草果種質(zhì)，在當(dāng)?shù)亟⒉莨N質(zhì)資源圃，對(duì)草果資源保護(hù)和育種利用具有重要意義。

4 結(jié)論

通過(guò)13個(gè)數(shù)量性狀指標(biāo)和5對(duì)SSR標(biāo)記分析金平草果遺傳多樣性水平，結(jié)果表明，金平草果具有豐富的表型變異和SSR標(biāo)記多樣性。13個(gè)數(shù)量性狀的變異系數(shù)為7.64%～50.00%，H′為1.74～2.16；5對(duì)SSR標(biāo)記在44個(gè)樣本中共擴(kuò)增出23個(gè)條帶，多態(tài)位點(diǎn)百分率為100%，I和平均PIC分別為1.266和0.672；聚類分析將44個(gè)樣本分為2大類，類群Ⅰ包括34個(gè)樣本，類群Ⅱ包括10個(gè)樣本。