王兵兵,李志遠(yuǎn),王心悅,韓小麗,剡根強(qiáng)>,王 建,馮廣余
(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832000;2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院,新疆 石河子 832000)
緩慢葡萄球菌(Staphy lococcus lentus)屬于微球菌科、葡萄球菌屬(Staphy lococcus)。在1976年該菌被Kloos等研究者命名為松鼠葡萄球菌緩慢亞種(Staphy lococcus sciuri subsp .lentus)[1],直到1983年由Schleifer K H等研究者將其劃分為葡萄球菌屬的一個(gè)獨(dú)立的種,緩慢葡萄球菌(S.lentus)[2]。
緩慢葡萄球菌屬于凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negative staphy loco cci,CNS)[1]。CNS是人體皮膚正常菌群之一,以前認(rèn)為緩慢葡萄球菌不具有致病性,但越來(lái)越多的研究表明CNS可引起人類及多種動(dòng)物發(fā)病,成為了不可忽視的致病菌,在人醫(yī)臨床上已成為醫(yī)院感染的重要致病菌。緩慢葡萄球菌是條件致病菌,特別對(duì)于新生幼兒或者患有嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾病以及長(zhǎng)期接受治療的病人等免疫力相對(duì)低下的人群更容易感,感染后如不能及時(shí)治療導(dǎo)致嚴(yán)重后果[3-6]。在動(dòng)物上引起奶牛乳腺炎、小鼠角膜炎、尿道炎、肺炎等疾病[4,7,8],目前未見(jiàn)蜂感染該菌的報(bào)道。
目前,國(guó)內(nèi)外科研人員對(duì)緩慢葡萄球菌的文獻(xiàn)報(bào)道較少,對(duì)其致病機(jī)理、感染時(shí)機(jī)、及臨床治療意義等尚不清楚[3],被用來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步研究的資料以及菌種資源也十分有限。本研究從死亡熊蜂幼蟲中分離鑒定一株緩慢葡萄球菌,并對(duì)其進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)研究,以期為進(jìn)一步探討該菌特性、對(duì)熊蜂人工飼養(yǎng)過(guò)程中的影響等提供相關(guān)資料和依據(jù)。
熊蜂發(fā)病幼蟲;API鑒定系統(tǒng)細(xì)菌鑒定儀,法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品;革蘭氏染液,購(gòu)買于珠海貝索生物技術(shù)有限公司;固體/液體LB培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;藥敏試驗(yàn)的藥敏紙片購(gòu)自上海伊化有限公司和杭州天和微生物制劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Easy Taq PCR Super Mix均購(gòu)買于北京全式金生物技術(shù)有限公司;PCR引物為北京六合華大基因科技有限公司合成。
1.2.1 細(xì)菌分離 無(wú)菌采取發(fā)病幼蟲在無(wú)菌環(huán)境下接種于液體LB培養(yǎng)基,在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后,接種于LB固體培養(yǎng)基37℃進(jìn)行培養(yǎng)24 h,挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。
1.2.2 生化鑒定試驗(yàn) 采用生化鑒定儀進(jìn)行生化鑒定。
1.2.3 細(xì)菌DNA提取 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌的基因組DNA。
1.2.4 PCR鑒定 細(xì)菌16SrRNA 序列的擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物。
引物序列如下:
正向引物27F:5′--AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG--3′
反向引物1 4 9 2 R:5′--T A C G G(C/T)TACCTTGTTACGACTT--3′
PCR反應(yīng)體系(25μl):上下游引物各1 μl,2×Easy Taq PCR Super Mix 12 μl,無(wú)菌水9 μl,DNA模板2 μl。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性,95 ℃,5 min;變性94 ℃,30 s,退火55 ℃,45 s,72 ℃延伸90 s,32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳驗(yàn)證片段大小與預(yù)期相符合后,送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序并比對(duì)測(cè)序結(jié)果。
1.2.5 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行頭孢他啶、慶大霉素和克林霉素等21種常用抗生素的抗菌敏感性測(cè)試37 ℃培養(yǎng)20 h后測(cè)量各藥物的抑菌圈大小,以判斷各種藥物對(duì)該菌的敏感性。
1.2.6 同源性比較 運(yùn)用DNAStar軟件的MegAlign程序進(jìn)行多重序列同源性比對(duì)。
1.2.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 應(yīng)用Mega5.0分析軟件進(jìn)行分析,通過(guò)Neighbor-Joining方法構(gòu)建遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
表1 生化鑒定
分離菌株SHZXF1為革蘭氏陽(yáng)性球菌,散在、多個(gè)聚集在一起分布(見(jiàn)圖1)。LB固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h后,形成灰白色的邊緣整齊、圓形凸起、表面濕潤(rùn)光滑的菌落(見(jiàn)圖2)。
圖1 分離菌鏡檢形態(tài)(革蘭染:10×100)
圖2 分離菌在LB瓊脂平板上菌落形態(tài)
生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。
經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),分離菌株(SHZXF1)DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段在1 000~1 00 bp之間,與預(yù)期目的片段1 400 bp相符(見(jiàn)圖3)。
圖3 PCR產(chǎn)物凝膠電泳
將分離菌SHZXF1 16SrRNA 基因序列在NCBI上進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì),結(jié)果顯示分離菌SHZXF1與Gen Bank登錄的中國(guó)黑龍江(EF528296.1)、智利圣地亞哥(EU794392.1)、英國(guó)北愛(ài)爾蘭(FJ794392.1---FJ795683.1)、印度(KM010146.1,KT26062.1)、法國(guó)(LC383925.1)等多株緩慢葡萄球菌同源性均達(dá)99.2%以上(見(jiàn)圖4)。
圖4 16SrRNA基因核苷酸序列與參考序列同源性比對(duì)
將分離菌SHZXF1 16SrRNA 基因序列與在NCBI登陸的緩慢葡萄球菌基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建,結(jié)果顯示分離菌SHZXF1與中國(guó)黑龍江(EF528296.1)、智利圣地亞哥(EU794392.1)、英國(guó)北愛(ài)爾蘭(FJ794392.1---FJ795683.1)、法國(guó)(LC383925.1)聚為同一支,與印度(KT260602.1、KT260615.1)聚為一大支(見(jiàn)圖5)。
圖5 16SrRNA基因核苷酸序列與參考序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)
藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 藥敏試驗(yàn)
葡萄球菌屬包含30多種葡萄球菌,但是只有3種葡萄球菌有細(xì)胞色素C而呈氧化酶陽(yáng)性反應(yīng),松鼠,緩慢和解酪葡萄球菌[9]。緩慢葡萄球菌與松鼠葡萄球菌的生物學(xué)特性非常相近,曾屬于松鼠葡萄球菌的遲緩亞種,緩慢葡萄球菌與松鼠葡萄球菌區(qū)別在于分解棉子糖陽(yáng)性。解酪葡萄球菌與松鼠葡萄球菌區(qū)別在于分解木糖、纖維二糖、甘露醇反應(yīng)陰性[8]。因此,依靠細(xì)菌的特殊生化特性,可以對(duì)氧化酶陽(yáng)性葡萄球菌作出鑒定。
緩慢葡萄球菌一度只被認(rèn)為是寄生在山羊和綿羊皮膚及粘膜上的正常菌群[10],但是,近年來(lái)更多的研究表明,該菌跟一些疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系,盛相鵬等報(bào)道了緩慢葡萄球菌可以造成倉(cāng)鼠的全身性菌血癥,并可以導(dǎo)致小鼠的慢性死亡;劉福來(lái)等研究表明緩慢葡萄球菌可以造成豬肺炎,引起死亡的病原菌[4,5,8,9]。
本研究從生病的熊蜂幼蟲中分離得到緩慢葡萄球菌,通過(guò)與16SrRNA基因進(jìn)行了PCR鑒定及基因同源性比較分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該分離株與中國(guó)黑龍江、智利圣地亞哥、英國(guó)北愛(ài)爾蘭、印度、法國(guó)等多株緩慢葡萄球菌同源性均達(dá)99.2%以上,這也說(shuō)明,緩慢葡萄球菌雖然在世界多國(guó)存在,但是彼此之間的基因差異性極小。藥敏試驗(yàn)研究表明,該分離株對(duì)多種抗生素敏感,可能是因?yàn)樵谀壳拔覈?guó)熊蜂人工飼養(yǎng)階段還沒(méi)有過(guò)多使用抗生素來(lái)進(jìn)行疫病防治。這也為以后熊蜂人工飼養(yǎng)期間疫病的防控提供了理論依據(jù)。
緩慢葡萄球菌與多種疾病密切相連,受到越來(lái)越多的關(guān)注,但是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)緩慢葡萄球菌的研究較少,特別是在蜂上的研究未見(jiàn)報(bào)道,其對(duì)蜂的致病性及臨床意義有待進(jìn)一步的研究,這對(duì)蜂病的防控及安全健康養(yǎng)殖具有重要意義。