綠豆谷氨酸脫羧酶的分離純化工藝

王憲青，魏 彤，石彥國

(1.哈爾濱商業(yè)大學食品科學與工程學院，黑龍江 哈爾濱 153000；2.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319)

γ-氨基丁酸(GABA)是植物細胞中自由氨基酸庫內的重要組成成分之一[1]，是由谷氨酸脫羧酶(GAD)催化谷氨酸生成的[2]。研究表明，GABA具有多項生物學活性，如促進生長激素分泌、改善大腦機能、防止老年動脈硬化、大腦中重要抑制性神經(jīng)遞質，還具有治療癲癇、抗焦慮、鎮(zhèn)靜、改善肝臟功能等功能[3-4]。但是，動植物內的GABA含量極低，無法大規(guī)模從中提取得到并加工利用。目前，常采用生物合成法和化學合成法兩種方法進行制備生產(chǎn)GABA。但化學合成法具有易殘留化學試劑、副反應不可控、反應條件劇烈等缺陷，不適用于食品的加工應用[5-6]。因此，常使用生物體內的GAD進行催化轉化谷氨酸生產(chǎn)GABA。

植物是提取GAD的重要原料之一，且植物內的GAD酶活性對植物生長、發(fā)育、成熟和衰老具有重要影響[7]。目前，相關研究也已從植物原料中檢測到GAD酶活力并提取分離得到了GAD。Inatami等[8]的研究表明，大麥中含有2種GAD同工酶，且具有極高的催化活性。范軍等[9]研究表明，小麥GAD由6個相同的亞基組成，分子量為310 kDa，和大腸桿菌內的GAD酶結構相似。張暉等[10]的研究表明米胚中GAD酶分子量為78 kDa，其活力受到Ca2+/CaM復合物的調節(jié)。姚琪等[11]對大豆中的GAD進行了提取、純化及酶學性質的研究，經(jīng)純化后其純度提高了4.7倍，但熱穩(wěn)定較差且酶活易受金屬離子的影響。前期實驗表明，綠豆也具有一定的GAD活性，可用來富集生產(chǎn)GABA。但目前為止，并未見到關于綠豆GAD提取純化的報道。

目前，關于GABA和GDA的生物學活性研究逐漸深入，但食品中的GABA含量和GDA酶活性的測定方法卻不多見。由于GABA對紫外、可見光的敏感度較低且酶活力易受外界環(huán)境所干擾降解，導致直接傳統(tǒng)方法對其進行測定比較困難。通過構建一種穩(wěn)定性好、重復性佳的測定方法是研究綠豆GAD酶的前提。有研究表明，柱前衍生法較紙層析法、比色法、液相法等穩(wěn)定性更高[12-13]，但關于OPA柱前自動衍生-紫外檢測法測定綠豆中GAD酶活性和GABA含量的可行性和測定方法還尚未有文獻報道。因此，通過構建綠豆GABA含量和GAD酶活性的檢測方法，并采用硫酸銨沉淀法、離子交換色譜、葡聚糖凝膠分離等方法構建分離純化工藝體系，進而得到酶活較高且成分單一的綠豆GAD組分，對綠豆精深加工和新型GABA的生產(chǎn)具有深遠的意義，同時也能豐富對植物GAD的了解，并從理論上為綠豆富集GABA提供支持。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

綠豆：產(chǎn)地海倫市，黑龍江國峰糧貿有限公司；2,4-二硝基氟苯(FDNB)，天津市永大化學試劑有限公司；甲醇，色譜純，中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司；GABA，美國Sigma公司；谷氨酸，上海生物試劑公司；硫酸銨，西隴化工股份有限公司；乙腈，色譜純，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；磷酸吡哆醛(PLP)，鄭州生化有限公司。

1.2 主要實驗設備

PC-2025高效液相色譜儀，上海天普有限責任公司；SG2型pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HD-3紫外檢測器，上海滬粵明科學儀器有限公司；ACPHAI-4 冷凍干燥機，CHRIST公司；色譜柱：漢邦Lichrospher C18色譜柱。

1.3 實驗方法

1.3.1GABA蛋白質含量的測定方法

準確配置GABA濃度為5 g/L的標準溶液，并將其稀釋至0.08、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56、0.64、0.80 g/L，配置體積分數(shù)1%FDNB的乙腈溶液作為衍生劑，取1 ml的標準GABA溶液或待測樣品于20 ml的棕色容量瓶中，并加入1 ml NaHCO3(濃度為0.5 mol/L，pH值為9.0)溶液，混勻后加入1 ml體積分數(shù)1%的2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液，放置于暗處60℃水浴1 h，冷卻至室溫后，加入pH7.0的磷酸鹽緩沖液至容量瓶刻度，混合均勻后8 000 r/min離心10 min，過0.45 μm濾膜暗處避光冷藏備用。在該衍生化條件下可保證衍生劑過量，樣品中的GABA完全被衍生化。采用液相色譜法進行測定各組分的峰面積，制作峰面積和GABA含量的標準曲線，根據(jù)標準曲線計算待測樣品中的GABA含量。檢測條件：檢測波長為360 nm；進樣量為20 μl；柱溫為35℃；流速為1.0 ml/min；洗脫條件A∶B=4∶6，其中A：CH3CN∶H2O=1∶1，B：pH7.0的磷酸鹽緩沖液。

1.3.2GAD酶活性測定

取0.5 ml待測樣品液，加入底物體積分數(shù)為1%的谷氨酸10 ml，于40℃下水浴2 h后，90℃滅酶處理5 min，8 000 r/min的條件下離心10 min，取上清液，柱前衍生法測定GABA含量，并以每30 min生產(chǎn)1 μmol GABA 作為一個谷氨酸脫羧酶酶活力單位。

1.3.3綠豆GAD的提取

準確稱取綠豆細粉200 g，加入提取液1 000 ml(50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH5.6，2 mmol/L巰基乙醇，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PLP，1 mmol/L PMSF和10%甘油)，用高速分散器(10 000 r/min，10 min)打成勻漿，4層紗布過濾，5 000 r/min，4℃離心25 min，上清液即為綠豆GAD提取液。

1.3.4綠豆GAD分離純化

1.3.4.1(NH4)2SO4沉淀純化法

由于綠豆GAD粗提液中的有效物質含量有限，為了達到較好的沉淀效果， 采用(NH4)2SO4固體進行鹽析，考察了(NH4)2SO4濃度(質量分數(shù)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)因素對綠豆GAD粗提液上清液和沉淀中GAD酶活性的影響。

1.3.4.2DEAE樹脂分離純化GAD

(1)最佳樹脂的選擇實驗

在250 ml具塞錐形瓶中加入預先處理好的三種樹脂各15 g，分別加入經(jīng)硫酸銨沉淀純化后的綠豆GAD溶液50 ml，使樹脂完全浸泡，封好放入180 r/min、30℃恒溫振蕩器中振蕩12 h后，吸取上清液1 ml，與4 ml雙縮脲試劑混合后，靜置30 min，在540 nm下分光光度測定蛋白質濃度，計算樹脂的吸附率。

吸附率=(C-C0)/C×100%，

式中，C、C0分別為吸附前后的蛋白質質量濃度，mg/ml。

(2)靜態(tài)吸附曲線實驗

向250 ml錐形瓶中加入5 g篩選出來的樹脂，向其中加入不同pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)條件下的綠豆GAD提取液100 ml，用塞子封好后放入恒溫搖床中振蕩(30℃，180 r/min)，隔1、4、8、12 h取液，測定吸附后溶液中的蛋白質含量，計算綠豆GAD吸附率，繪制靜態(tài)吸附曲線。

(3)靜態(tài)解吸驗及洗脫劑的選擇

按照1.3.4.2中的(2)進行靜態(tài)吸附，恒溫振蕩器吸附震蕩12 h，待其充分吸附后去除過濾，再將吸附后的樹脂重新置于250 ml錐形瓶中，選擇不同離子濃度的洗脫溶劑進行洗脫，洗脫劑分別選用離子濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L的氯化鈉溶液各100 ml，在同條件下振蕩，待解吸10、20、30、40、50 min后，測定解吸液的體積及蛋白質含量，計算樹脂解吸前后的蛋白質質量，繪制靜態(tài)解吸曲線。

解吸率=(m0-m)/m0×100%，

式中，m0為解吸前的樹脂內的蛋白質量，mg；m為解吸后樹脂內的蛋白質量，mg。

(4)動態(tài)吸附和解吸實驗

將處理過的DEAE-Cellulose樹脂裝入1.0 cm×100 cm的層析柱中，在30℃條件下將 pH7.0的綠豆GAD提取液分別以1.0、1.5、2.0 ml/min流速上柱，并檢測流出液的蛋白質質量濃度，繪制動態(tài)解吸曲線，確定最佳進樣體積及進樣質量。

1.3.4.3葡聚糖凝膠層析純化

實驗選擇葡聚糖凝膠Sephadex G-100作為層析純化的樹脂，將預處理后的葡聚糖凝膠Sephadex G-100裝入1.6 cm×100 cm的玻璃層析柱，然后洗脫3個柱體積的超純水。上樣5 ml，洗脫流速0.2 ml/min，于280 nm 下測吸收度，繪制洗脫曲線，并收集各峰的洗脫液，凍干后測GAD酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗都進行3組平行實驗，采用 Origin 8.5軟件分析數(shù)據(jù)并作圖。利用SPSS Statistics 22 軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，P<0.05 為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 GABA濃度標準曲線的確定

衍生劑其衍生物的液相色譜圖見圖1。

(a)

(b)

將衍生劑和衍生化處理后的樣品進行液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，衍生劑峰在7.348 min處，衍生物的峰在10.953 min處。將濃度為0.08、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56、0.64、0.80 g/L GABA標準品分別進行衍生化處理，進樣檢測，計算GABA衍生化產(chǎn)物的峰面積，以GABA濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程：

Y=1.112 7X+0.000 286，

R2=0.998 92，

線性范圍為0.08～0.80 g/L，精密度RSD為0.054%。

2.2 綠豆GAD粗提液的衍生化處理實驗

綠豆GDA粗提液衍生化反應液相色譜圖見圖2。

圖2 綠豆GDA粗提液衍生化反應的液相色譜圖

綠豆組織的酶活測定反應液經(jīng)上述衍生化反應后，用RP-HPLC測定生成的GABA含量，并由此來計算植綠豆的GAD活力。在選定的衍生化和色譜條件下，綠豆樣品中的GABA衍生物得到良好的分離效果，且RSD=0.91%。這表明FDNB衍生測定方法適用于綠豆中GAD活性的測定。

2.3 (NH4)2SO4沉淀純化綠豆GAD

(NH4)2SO4濃度對綠豆GAD酶活力的影響見圖3。

圖3 (NH4)2SO4濃度對綠豆GAD酶活力的影響

由圖3可知，當(NH4)2SO4質量分數(shù)為10%～30%時，上清液中的酶活力基本沒有下降，而沉淀中的蛋白質在(NH4)2SO4質量分數(shù)為10%～20%時，也沒有GAD酶活性。這表明較低濃度的(NH4)2SO4并不能有效沉淀出具有GAD酶活性的蛋白質。隨著(NH4)2SO4濃度的繼續(xù)升高，上清液中的酶活性開始下降。當質量分數(shù)超過70%時，上清液的GAD酶活性幾乎完全喪失；而沉淀中的酶活性達到最大，且梯度間差異不顯著。這表明(NH4)2SO4的質量分數(shù)為70%～90%時，能將具有谷氨酸脫羧酶的蛋白質沉淀下來?？紤]到成本問題，將(NH4)2SO4的質量分數(shù)70%作為較適純化條件。

2.4 DEAE-Cellulose法純化綠豆GAD

2.4.1樹脂類型對綠豆GAD吸附率的影響

不同樹脂對綠豆GAD的吸附率見圖4。

圖4 不同樹脂對綠豆GAD的吸附率

由圖4可知，不同樹脂類型對綠豆GAD的吸附率不同，DEAE-Cellulose樹脂對綠豆GAD的吸附率最高。這與樹脂的制備條件、活性基團的組成、種類、形狀和大小有關。因此，后續(xù)實驗選擇DEAE-Cellulose樹脂進行綠豆GAD的純化實驗。

2.4.2不同pH值的綠豆GAD溶液靜態(tài)吸附曲線

不同pH值條件和吸附時間下的綠豆GAD溶液靜態(tài)吸附率見圖5。

圖5 不同pH值條件和吸附時間下的綠豆GAD溶液靜態(tài)吸附率

由圖5可知，綠豆GAD溶液的pH值和吸附時間對吸附率均具有顯著影響。在同一pH值的條件下，隨著吸附時間的延長，DEAE-Cellulose樹脂對綠豆GAD的吸附率呈現(xiàn)上升趨勢。在同一吸附時間的條件下，隨著pH值的升高，DEAE-Cellulose樹脂對綠豆GAD的吸附率呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，但均在綠豆GAD溶液pH值為7時達到最高。這是因為谷氨酸脫羧酶屬于兩性物質，在不同pH值的環(huán)境下與水溶液的離子化程度不同，其暴露的基團和表面電荷的正負及帶電量均不相同，進而影響樹脂與GAD之間的相互結合作用，造成樹脂的吸附效果不同[14-15]。因此，選擇綠豆GAD溶液的pH值為7.0作為較適pH值。

2.4.3靜態(tài)解吸實驗及解吸劑的選擇

不同離子濃度的洗脫劑對綠豆GAD解吸率的影響見圖6。

圖6 不同離子濃度的洗脫劑對綠豆GAD解吸率的影響

由圖6可知，隨著離子濃度的提高，解吸劑對綠豆GAD的解吸率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且在離子濃度為0.6 mol/L時達到最高。隨著解吸時間的延長，解吸劑對綠豆GAD的解吸率呈現(xiàn)先升高后趨于平穩(wěn)的趨勢；且解吸時間超過30 min后，解吸量基本趨于平穩(wěn)。這是隨著解吸時間的延長，解吸液和吸附在樹脂上的GAD接觸的幾率就更多，更易將GAD從樹脂上洗脫下來[12,16-17]。但是當達到一定的解吸時間后，樹脂對GAD的吸附和解吸達到動態(tài)平衡，再隨著解吸時間的延長，其解吸量不會隨之增加。因此，選擇解吸液中離子濃度0.6 mol/L作為較適的洗脫劑濃度。

2.4.4DEAE-Cellulose樹脂動態(tài)吸附與解吸實驗

2.4.4.1最佳進料速度及進料量的選擇

不同流速和進料量對綠豆GAD吸附率的影響見圖7。

圖7 不同流速和進料量對綠豆GAD吸附率的影響

由圖7可知，隨著進料量的增大，樹脂對綠豆GAD吸附率呈現(xiàn)下降趨勢；隨著流速的增大，樹脂對綠豆GAD吸附率現(xiàn)下降趨勢，且流速超過1.5 ml/min后，吸附量急劇下降。這主要是因為樹脂的最大吸附量是一定的，當進料量過小，無法對資源進行充分利用，而進料量過大超過了樹脂的最大吸收范圍后會造成原料的浪費[18-19]。進料流速直接決定了吸附物質向樹脂的擴散程度和結合率，當流速過低，雖然樣品可以和樹脂進行充分接觸，但是會延長工業(yè)化處理時間和生產(chǎn)成本；而流速過高，會造成吸附物質還尚未及時和樹脂進行相互結合就被沖刷下來，造成吸附量太少[20]。因此，綜合考慮原料成本、生產(chǎn)周期和吸附量多方面因素，選擇上樣流速1.5 ml/min為較適流速，進料量為6 ml為較適進樣量。

2.4.4.2動態(tài)解析實驗

綠豆GAD的動態(tài)解析曲線見圖8。

圖8 綠豆GAD的動態(tài)解析曲線

由圖8可知，在pH 7.0的緩沖溶液和離子強度為0.6 mol/L的洗脫劑條件下，綠豆GAD共被洗脫出三個蛋白質峰。分別收集三個峰的蛋白質溶液進行GAD酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，洗脫峰2具有較高的酶活性。這表明通過DEAE-Cellulose樹脂分離純化后，具有GAD酶活性的組分主要集中在洗脫峰2內。由于洗脫峰1和洗脫峰3的酶活性較小，因此只收集洗脫峰2進行后續(xù)純化實驗。

2.5 葡聚糖凝膠Sephadex G-100純化綠豆GAD

綠豆GAD的Sephadex G-100純化色譜圖見圖9。

圖9 綠豆GAD的Sephadex G-100純化色譜圖

由圖9可知，綠豆GAD經(jīng)葡聚糖凝膠色譜純化后，得到三個分子量的小峰，富集各峰值管的蛋白質溶液，透析脫鹽后冷凍干燥。通過GAD酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，峰1和峰2具有較高的酶活性，并將峰1和峰2收集得到的蛋白質分別命名為GAD1和GAD2。這表明經(jīng)過葡聚糖凝膠層析柱洗脫分離后，得到2個具有谷氨酸脫羧酶活性的組分，即GAD1和GAD2。

2.6 GAD分離純化結果

分別測定綠豆GAD 分離純化過程中，各步所收集酶液的酶活力、蛋白質含量，結果見表1。

由表1可知，色譜法純化后的綠豆GAD1純化倍數(shù)為100.63，酶的比活力達到240.56 U/mg，酶回收率為17.77%；GAD2的純化倍數(shù)為118.52，酶的比活力為283.32，酶回收率為20.08%。由此可見，通過(NH4)2SO4分級沉淀、DEAE-Cellulose樹脂純化、葡聚糖凝膠Sephadex G-100純化可進行綠豆GAD的分離純化，并得到了綠豆中的兩種GAD同工酶。

3 結論

本實驗采用柱前衍生法測定GABA含量的標準曲線為：Y=1.112 7+0.000 286，R2=0.998 92，線性檢測范圍為0.08～0.80 g/L，精密度RSD為0.054%；并建立了硫酸銨沉淀法、DEAE-Cellulose離子交換色譜法、葡聚糖凝膠Sephadex G-100層析法分離純化體系，經(jīng)純化后得到2種綠豆GAD同工酶，綠豆GAD1純化倍數(shù)為100.63，酶的比活力達到240.56 U/mg，酶回收率為17.77%；GAD2的純化倍數(shù)為118.52，酶的比活力為283.32，酶回收率為20.08%。