沙蠶多糖提取工藝及抗氧化活性研究

金立新，陳麗，3，，高仁姣，鮑佳琦，吳海龍，饒杰，張碩

（1.淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室，江蘇 連云港 222005；3.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005）

沙蠶屬于環(huán)節(jié)動物多毛綱沙蠶屬。我國沙蠶種類豐富，約有80 余種，主要分布于東部沿海河口灘涂地帶。沙蠶營養(yǎng)價值高，干品中粗蛋白占60%以上，氨基酸種類齊全，人體必需氨基酸和呈味氨基酸含量高[1-2]，有“天然味精”之稱。沙蠶的纖維蛋白溶解酶、金屬蛋白酶、抗凝血肽等能預(yù)防高血壓、動脈硬化、腦血栓等疾病[3-5]，還有豐富的高不飽和脂肪酸[6]、羥氨酸，被譽為海中的“冬蟲夏草”[7]，具有很好的開發(fā)利用前景。江蘇沙蠶分布量多，約占全國總量的1/3，但目前沙蠶研究多為水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料[8-9]、環(huán)境指示生物[10-11]等，沙蠶多糖、多肽等活性物質(zhì)研究和高值化產(chǎn)品研發(fā)報道較少。海洋生物多糖具有抗腫瘤、免疫促進、降血糖、抗氧化等活性[12-16]。沙蠶是重要的環(huán)境指示生物，在耐受重金屬及有機質(zhì)污染時表現(xiàn)出較強的抗氧化性[17]，本研究提取沙蠶多糖并測定其抗氧化活性，以期為沙蠶的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙蠶：捕于連云港海州灣海域，洗凈凍干粉碎，75 %乙醇脫脂，烘干至恒重；DPPH 試劑：上海躍騰生物技術(shù)有限公司；抗壞血酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、蒽酮、氯仿、正丁醇、雙氧水、濃硫酸、冰乙酸、無水葡萄糖（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；羥自由基試劑盒、超氧陰離子自由基試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Freezone 6 PLus 冷凍干燥機：美國Labconco 公司；JP-300A 型高速粉碎機：永康市久品工貿(mào)有限公司；BS323S 電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；MuLtifuge X3R 高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技有限公司；OSB-2100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海泉杰儀器有限公司；MS-PB 磁力攪拌器：美國SCILOGEX 公司；DHG-9240A 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海易研實驗設(shè)備有限公司；1510 酶標儀：美國Thermo Fisher 公司。

1.3 方法

1.3.1 沙蠶粗多糖提取

采用水提醇沉法。準確稱取沙蠶粉10 g 放入三角瓶中，加入適量蒸餾水浸提，分別按照試驗設(shè)置的提取溫度、提取時間、料液比，恒溫攪拌，離心收集上清液，重復(fù)提取2 次，上清液過濾，濾液減壓濃縮至原體積的1/20 后，加4 倍體積95%乙醇沉淀12 h，沉淀經(jīng)無水乙醇洗滌，恒溫干燥得粗多糖。

1.3.2 沙蠶多糖含量測定

采用蒽酮-硫酸法[18]。以葡萄糖為標準物做標準曲線。配制1 mg/mL 沙蠶粗多糖溶液，測定620 nm 處的光密度值，由回歸方程計算得到沙蠶多糖含量X。

1.3.3 沙蠶多糖提取率計算

沙蠶多糖提取率Y/%=W1×X/W×100

式中：W1為測定用沙蠶粗多糖重量，g；X 為沙蠶粗多糖中的糖含量，%；W 為提取用沙蠶粉重量，g。

1.3.4 沙蠶多糖提取單因素條件試驗

分別設(shè)置不同提取溫度（60、70、80、90、100 ℃）、提取時間（1、2、3、4、5 h）和料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 和 1∶50（g/mL）]，根據(jù) 1.3.1 方法，提取沙蠶多糖。提取到的多糖根據(jù)1.3.2 方法測定糖含量后，計算提取率。

1.3.5 沙蠶多糖提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 設(shè)計三因素三水平試驗，并用響應(yīng)面法分析優(yōu)化提取條件。

1.3.6 沙蠶多糖體外抗氧化活性測定

分別配制系列濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL） 的脫蛋白沙蠶多糖溶液，以VC溶液作陽性對照，按以下方法分別測定不同濃度沙蠶多糖對不同自由基的清除能力。

1.3.6.1 羥自由基清除能力測定

采用羥自由基測定試劑盒測定。羥自由基清除能力的定義：規(guī)定每毫升沙蠶多糖溶液于37 ℃反應(yīng)1 min，使體系中H2O2濃度下降1 mmol/L 為一個清除能力單位。

式中：V 為樣品測定用的體積，mL；N 為樣品測試前稀釋倍數(shù)。

式中：OD 為 550 nm 波長處的光密度值；V 為樣品測定用的體積，mL；N 為樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.3.6.2 超氧陰離子自由基清除能力測定

采用超氧陰離子自由基測定試劑盒測定。超氧陰離子自由基清除能力的定義：在反應(yīng)系統(tǒng)中，每毫升多糖溶液于37 ℃反應(yīng)40 min 所抑制的超氧陰離子自由基相當(dāng)于1 mg 的維生素C 所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為一個活力單位。

式中：OD 為450 nm 波長處的光密度值；N 為樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.3.6.3 DPPH 自由基清除能力測定

取棕色 EP 管 3 支，編號，1 號管加 200 μL 多糖溶液和200 μL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，混勻，避光反應(yīng)30 min 后離心取上清液，測OD517，記作 A1；2 號管加200 μL 多糖溶液和 200 μL 無水乙醇混勻，測 OD517，記作 A2；3 號管加 200 μL 無水乙醇和 200 μL 0.2 mmol/L DPPH 溶液混勻，測 OD517，記作 A3。以 VC作陽性對照，取不同濃度沙蠶多糖均按以上操作分別測定DPPH 自由基清除能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙蠶多糖提取的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 溫度對沙蠶多糖提取的影響

溫度對沙蠶多糖提取率的影響見圖1。

圖1 溫度對沙蠶多糖提取的影響Fig.1 Effect of temperature on the extraction yield of PNS

由圖1 可知，溫度在 60 ℃～90 ℃范圍內(nèi)，沙蠶多糖提取率隨溫度增加而提高，90 ℃時達到最大值，高于90 ℃后提取率開始下降。因此選擇90 ℃為沙蠶多糖提取的最適溫度。

2.1.2 時間對沙蠶多糖提取的影響

時間對沙蠶多糖提取率的影響見圖2。

圖2 時間對沙蠶多糖提取的影響Fig.2 Effect of time on the extraction yield of PNS

由圖2 可知，多糖提取率隨提取時間延長而不斷增加，在3 h 前增加較明顯，后趨于平緩，因此，選擇沙蠶多糖提取的時間為3 h。

2.1.3 料液比對沙蠶多糖提取的影響

提取時間3h、提取溫度90 ℃條件下，料液比對沙蠶多糖提取率的影響見圖3。

由圖3 可知，沙蠶多糖提取率隨加水量增加而逐漸增大，1∶30（g/mL）后，提取率變化不明顯，說明水分增加有利于多糖的提取，但加水量過大，會增加后續(xù)濃縮難度，因此選擇沙蠶多糖提取的料液比為1∶30（g/mL）。

圖3 料液比對沙蠶多糖提取的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on the extraction yield of PNS

2.2 沙蠶多糖提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1 試驗設(shè)計方案和結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）為自變量，沙蠶多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken 設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面分析試驗，試驗因素與水平設(shè)計見表1，試驗結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

表2 響應(yīng)面試驗分析方案及結(jié)果Table 2 Response surface analysis scheme and result

2.2.2 模型擬合

利用Design Expert 10.0.3 軟件對表2 試驗數(shù)據(jù)進行響應(yīng)面分析，結(jié)果見表3，得到沙蠶多糖對提取溫度（A）、料液比（B）、提取時間（C）的回歸方程為：Y=1.75+0.027A+0.041B+0.041C-8.325×10-3AB-6.700×10-3AC+0.014BC-0.030A2-0.041B2-0.050C2。由表3模型的方差分析可知回歸模型P 值＜0.01，說明本試驗所采取的二次多項式模型極顯著，失擬項P 值0.057 5＞0.05 不顯著，回歸模型的決定系數(shù)R2=0.977 9，R2Adj=0.949 5，說明模型的擬合度好，試驗方法可靠，能夠準確預(yù)測和分析多糖的提取率大小。提取溫度A、料液比B 和提取時間C 對沙蠶多糖提取率均有顯著影響，影響大小為料液比＞提取時間＞提取溫度。兩兩因素交互影響AB、AC和BC 項不顯著（P＞0.05），說明沙蠶多糖提取率受提取溫度、料液比和提取時間之間交互作用的影響小。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Regression analysis results of variance analysis

2.2.3 響應(yīng)面直觀分析

根據(jù)回歸方程，得到影響沙蠶多糖提取率的提取溫度、料液比、提取時間等3 因素兩兩交互作用的響應(yīng)曲面和等高線，結(jié)果見圖4 至圖6。

由圖4 可知，沙蠶多糖提取率受提取溫度和提取時間交互作用的影響較小，等高線圖為橢圓形，說明沙蠶多糖提取率在合適的溫度和提取時間下具有極大值。當(dāng)將取溫度固定，分析提取時間對沙蠶多糖提取率的影響，曲線先升高后下降，同樣固定提取時間，沙蠶多糖提取率隨提取溫度的增大表現(xiàn)為先上升后下降，因此實際提取時應(yīng)該控制提取溫度和提取時間在最佳范圍內(nèi)。

圖4 提取溫度和時間交互作用對多糖提取率的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.4 Temperature and time response surface and contour plot

圖5 料液比和提取時間交互作用對多糖得率的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.5 Material-liquid ratio and time response surface and contour plot

由圖5 可知，沙蠶多糖提取率受提取時間和液料比交互作用影響較小，表現(xiàn)為響應(yīng)面坡度較陡，響應(yīng)面圖均呈現(xiàn)拋物線型，等高線圖為橢圓形說明沙蠶多糖提取率在合適的提取時間和液料比下具有極大值。因此在實際操作中可以適當(dāng)增長提取時間增大料液比來提高多糖的得率。

由圖6 可知，固定提取溫度，沙蠶多糖提取率隨液料比的增大表現(xiàn)為先急劇上升后緩慢下降，因此在實驗中可以適當(dāng)增大料液比。當(dāng)固定液料比，沙蠶多糖提取率隨溫度的增大表現(xiàn)為先上升后下降。等高線圖為橢圓形說明沙蠶多糖提取率在合適的提取溫度下具有極大值。

2.2.4 驗證試驗

通過Design Expert10.0.3 軟件分析得到提取溫度為83.36 ℃、料液比為 1∶24.56（g/mL）、提取時間為 3.53 h條件下，沙蠶多糖的預(yù)測提取率為1.774%。由于實際操作的局限性，分別將提取溫度、時間和料液比調(diào)整為 83 ℃、1∶25（g/mL）和 3.5 h。在此條件下多糖提取率為1.76%，與模型預(yù)測值相近，說明該模型有效，得到的沙蠶多糖提取條件具有應(yīng)用價值。

圖6 料液比和提取溫度交互作用對多糖得率的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.6 Material-liquid ratio and temperature response surface and contour plot

2.3 沙蠶多糖體外抗氧化活性測定

2.3.1 羥自由基清除能力測定

沙蠶多糖對羥自由基清除能力測定結(jié)果見圖7。

圖7 沙蠶多糖對羥自由基的清除作用Fig.7 Scavenging activity of PNS on hydroxyl radical

由圖7 可知，沙蠶多糖對羥自由基有較強清除能力，多糖濃度在0.1 mg/mL～0.6 mg/mL 時，羥自由基清除率由18 %快速提高到71 %，之后趨于平緩，超過1 mg/mL 時，清除率開始下降。

2.3.2 超氧陰離子自由基清除能力測定

沙蠶多糖對超氧陰離子自由基清除能力測定結(jié)果見圖8。

圖8 沙蠶多糖對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.8 Scavenging activity of PNS on superoxide radical

由圖8 可知，多糖濃度在0.1 g/mL～1.8 g/mL 范圍內(nèi)，超氧陰離子自由基清除率隨多糖濃度增加而升高，濃度大于1.8 mg/mL 后，清除率開始下降。多糖濃度為1.4 mg/mL 時，對超氧陰離子自由基的清除率可達到50%以上。

2.3.3 DPPH 自由基清除能力測定

沙蠶多糖對DPPH 自由基清除能力測定結(jié)果見圖9。

圖9 沙蠶多糖對DPPH 自由基的清除作用Fig.9 Scavenging activity of PNS on DPPH radical

由圖9 可知，沙蠶多糖對DPPH 自由基具有較強清除能力，清除率隨著多糖濃度增加而增大。多糖濃度為1.4 mg/mL 時，對DPPH 自由基的清除率達到50%以上。

3 結(jié)論

海洋多糖在食品添加劑[19-20]、保鮮劑[21]、藥物載體[22]、水產(chǎn)養(yǎng)殖[23]、化妝品[24]等方面均有廣泛應(yīng)用。本文以多糖提取率為指標，在單因素試驗為基礎(chǔ)，采用響應(yīng)面法，對沙蠶多糖提取的工藝進行優(yōu)化，利用Design Expert10.0.3 程序軟件對三元二次回歸模型進行擬合分析，沙蠶多糖提取的最佳溫度為83.36 ℃、料液比為 1∶24.56（g/mL）、時間為3.53 h，沙蠶多糖得率為1.774%。根據(jù)優(yōu)化后條件，為溫度為83 ℃、料液比為1∶25（g/mL）、時間為 3.5 h 得到沙蠶多糖提取率為（1.76±0.01）%，與模型預(yù)測值的誤差較小，說明該模型能較好的預(yù)測沙蠶多糖的提取率，可用于沙蠶多糖提取率的預(yù)測。

沙蠶多糖對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH 自由基均有較好的清除作用。對羥自由基的抑制效果最好，多糖濃度為0.6 mg/mL 時，對羥自由基的清除率超過70%；多糖濃度為1.4 mg/mL 時，對超氧陰離子自由基及DPPH 自由基的清除率都達到50%以上。本研究表明沙蠶多糖具有較強的體外抗氧化活性，可為沙蠶的高值化利用和產(chǎn)品開發(fā)提供一定依據(jù)。