含Glypican3 單克隆抗體電子順磁共振成像診斷劑的合成與性能

孫 麗，沈艷春，彭宇霄，沈于堯，劉琪鈺，周子琪，劉 凡，鄢國(guó)平

材料科學(xué)與工程學(xué)院，化工與制藥學(xué)院，武漢工程大學(xué)，湖北 武漢 430205

肝癌是全世界四大癌癥致死疾病之一，其中90%的肝癌是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），且80%～90%的肝細(xì)胞癌都伴隨有肝硬化（liver cirrhosis，LC），由于早期HCC 臨床癥狀與LC難以區(qū)分，患者往往在癌癥晚期才會(huì)被確診［1-3］。目前常用的腫瘤標(biāo)記物甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）存在假陽(yáng)性和假陰性等缺點(diǎn)，降低了其對(duì)腫瘤檢測(cè)的準(zhǔn)確度。因此，對(duì)于肝癌細(xì)胞與肝良性病變鑒別的臨床研究具有極其深遠(yuǎn)的意義［4-5］。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）是一種位于細(xì)胞膜上的腫瘤胚胎期蛋白多糖，在肝癌細(xì)胞中特異性高度表達(dá)，而在正常細(xì)胞中不表達(dá)，因此GPC3被廣泛用作為肝細(xì)胞癌的治療靶點(diǎn)［6］。Glypican3 單克隆抗體（glypican-3 monoclonal antibody，GPC3-mAb）可與GPC3 特異性結(jié)合，被廣泛用作肝癌識(shí)別基團(tuán)［7］。

卟啉類(lèi)衍生物是一類(lèi)芳香類(lèi)四吡咯化合物，存在于植物和動(dòng)物體內(nèi)，如葉綠素和血紅素，能與癌細(xì)胞特異性結(jié)合并富集在腫瘤組織中［8］。卟啉可以通過(guò)插入到DNA 的堿基中，導(dǎo)致其斷裂而阻止腫瘤的形成。同時(shí)，卟啉類(lèi)分子具有平面大環(huán)π-π共軛結(jié)構(gòu)，易于被化學(xué)修飾，且能吸收可見(jiàn)光并發(fā)射熒光，具有較高的發(fā)光量子產(chǎn)率［9-11］。

電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）是由未配對(duì)電子的磁矩發(fā)展的一種磁共振技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)未成對(duì)電子探索其周?chē)h(huán)境，具有靈敏度強(qiáng)、分辨率高的優(yōu)點(diǎn)［12-18］。本文在催化劑的作用下，采用5-苯氧乙酸乙酯聯(lián)吡咯甲烷為原料通過(guò)Lindsedy 法成環(huán)法等一系列反應(yīng)，將5-醛基異氮雜茚氮氧自由基（5-formyl-1，1，3，3-tetramethylisoindolin-2-yloxyl，F(xiàn)TMIO）和GPC3-mAb 引 入到卟啉環(huán)上，合成GPC3 單克隆抗體電子順磁共振成 像 診 斷 劑——5-（1'，1'，3'，3'-四 甲 基-異 氮 雜茚-2'-氧化氮自由基）-10，15，20-三（4"-氧乙酸基苯基）卟啉-GPC3 抗體［5-（1'，1'，3'，3'-tetramethylisoindolin-2'-yloxyl-5'-yl）-10，15，20-tris（4"-carboethoxymethyleneoxyphenyl）-porph-yrin glypican-3 monoclonal antibody，TmioTCPP-GPC3-mAb］，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，進(jìn)一步測(cè)試其熒光、電化學(xué)與EPR性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 化學(xué)試劑與材料

1.1.1 主要化學(xué)試劑 三氟化硼乙醚絡(luò)合物、2，3-二氯-5，6-二氰對(duì)苯醌、正己烷、三氟乙酸、無(wú)水硫酸鈉、乙醇胺、N-（對(duì)-馬來(lái)酰亞胺基苯基）異氰酸酯、二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、氫氧化鉀、氫氧化鈉、對(duì)羥基苯甲醛、乙酸乙酯、甲醇、四丁基氟化銨、溴乙酸乙酯（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。GPC3-mAb（分子量為66 kD，華中科技大學(xué)協(xié)和醫(yī)院），-20 ℃下儲(chǔ)存。吡咯用前重蒸，二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethyl-formamide，DMF）、乙醚、DMSO 均除水重蒸后備用。FTMIO，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)T-IR）用Thermo 公司Nicolet Impact 420 型傅里葉變換紅外分析儀測(cè)定；質(zhì)譜（mass spectrum，MS）用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的Voyager-DE-STR 激光時(shí)間質(zhì)譜計(jì)測(cè)定；熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜用Varian Eclipse 熒光分光光度計(jì)測(cè)定；EPR 譜采用BRUKER A300 電子順磁共振波譜儀測(cè)定；電化學(xué)性能在CHI660D 電化學(xué)工作站上測(cè)試。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 5-苯氧乙酸乙酯雙吡咯的合成 稱(chēng)取6.5 g對(duì)羥基苯甲醛和9.78 g 溴乙酸乙酯溶解于干燥丙酮（100 mL）中，并加入適量的K2CO3回流反應(yīng)12 h，加水稀釋到200 mL，用乙醚萃取3 遍，取有機(jī)層用氫氧化鉀洗滌3 次，無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，真空干燥得對(duì)醛基苯氧乙酸乙酯（8.2 g，77.2%）。

避光氮?dú)獗Ｗo(hù)，將1.0 g 對(duì)醛基苯氧乙酸乙酯和40 mL 吡咯加入到三口瓶中，溶解完全后滴加0.05 mL 三氟乙酸到反應(yīng)液中，常溫反應(yīng)1.5 h，加入0.6 g 氫氧化鈉終止反應(yīng)，攪拌30 min 后過(guò)濾，減壓干燥，用硅膠層析柱分離提純，真空干燥得到5-苯氧乙酸乙酯雙吡咯（0.80 g，51%）。

1.2.2 5-（1'，1'，3'，3'-四甲基-異氮雜茚-2'-氧化氮自由基）-10，15，20-三（4"-氧乙酸基苯基）卟啉［5-（1'，1'，3'，3'-tetramethylisoindolin-2'-yloxyl-5'-yl）-10，15，20-tris（4"- carboethoxymethyleneoxyphenyl）-porphyrin，TmioTCPP］的合成 在避光氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將0.74 g 5-苯氧乙酸乙酯雙吡咯和0.5 g FTMIO 溶解在230 mL 二氯甲烷中，在攪拌下將0.301 mL 三氟化硼乙醚絡(luò)合物加入到反應(yīng)瓶中，反應(yīng)1 h。再加入0.401 g 2，3-二氯-5，6-二氰對(duì)苯醌，攪拌反應(yīng)12 h。減壓干燥，柱層析分離提純后真空干燥得到中間體5，10，15-三（4"-氧乙酸乙酯基苯基）-20-（1'，1'，3'，3'-四甲基-異氮雜茚-2'-氧化氮自由基）卟啉［5，10，15-tris（4"-aceticoxyphenyl）20-（1'，1'，3'，3'-tetramethylisoindolin-2'-yloxyl-5'-yl）-porphyrin，TmioTECPP］（0.11 g，4.7%）。

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將0.3 g TmioTECPP 加到甲醇/氫氧化鈉水溶液（體積比為1∶1）混合液中，在50 ℃下反應(yīng)5 h，用甲醇萃取3 遍，減壓干燥得到產(chǎn)品TmioTCPP（0.2 g，72.7%）。

1.2.3 TmioTCPP-GPC3-mAb 的合成 精確稱(chēng)量10 mg TmioTCPP 和0.6 μL 乙醇胺溶于2 mL DMF中，再加入2.17 mg 二環(huán)己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC），常溫下持續(xù)反應(yīng)2 d，反應(yīng)液真空旋干，用硅膠層析柱分離提純，真空干燥得到中間體（5.2 mg，48.2%）。在避光氮?dú)獗Ｗo(hù)下再將其和1.3 mg N-（對(duì)-馬來(lái)酰亞胺基苯基）異氰酸酯溶于DMSO 中，常溫反應(yīng)2 h，真空除去溶劑，用硅膠層析柱分離提純得到活化的TmioTCPP（紫紅色，1.4 mg，56.4%），備用。

量取10 μL 磷 酸三（2-氯乙基）酯 加入到GPC3-mAb 的磷酸鹽緩沖液（1.515×10-5mmol/mL，10 μL）中，室溫?cái)嚢?0 min，將活化的TmioTCPP的磷酸鹽緩沖液（15.15 μL，1×10-4mmol/mL）滴加至反應(yīng)液中，室溫反應(yīng)2 h，透析12 h，冷凍干燥得到產(chǎn)品TmioTCPP-GPC3-mAb。合成線路如圖1所示。

1.2.4 結(jié)構(gòu)表征與性能測(cè)試 配制TmioTCPPGPC3-mAb、TmioTCPP 和FTMIO 二氯甲烷溶液，以四丁基氟化銨（0.1 mol/L）為電解質(zhì)，掃描速率為0.1 V/s，參比電極為Ag/AgCl，在CHI660D 電化學(xué)工作站上三電極系統(tǒng)上測(cè)定其循環(huán)伏安性能。

配制TmioTCPP-GPC3-mAb 和TmioTCPP 的磷酸鹽緩沖液，在熒光分光光度計(jì)上測(cè)定其激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)。

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，配制TmioTCPP-GPC3-mAb（1.5×10-10mol/L）水溶液，在室溫下用電子順磁共振波譜儀測(cè)試EPR 性能。

圖1 TmioTCPP-GPC3-mAb 的合成路線Fig.1 Synthetic route of TmioTCPP-GPC3-mAb

2 結(jié)果與討論

2.1 TmioTCPP 及其中間產(chǎn)物的表征

TmioTECPP 按照文獻(xiàn)［19］報(bào)道的方法合成，對(duì)應(yīng)質(zhì)譜圖譜中的分子離子峰1 034.48（M+）［圖2（a）］，與目標(biāo)產(chǎn)物（C62H58N5H10，Mr=1 034）結(jié)果一致。

對(duì)TmioTECPP 進(jìn)行脫酯基處理，得到中間體TmioTCPP，對(duì)應(yīng)質(zhì)譜圖的分子離子峰（M+H+）為949［圖2（b）］，與目標(biāo)產(chǎn)物（C55H46N5O10，Mr=948）結(jié)果一致。

圖2 質(zhì)譜圖：（a）TmioTECPP，（b）TmioTCPPFig.2 Mass spectra：（a）TmioTECPP，（b）TmioTCPP

2.2 TmioTCPP-GPC3-mAb 的FT-IR 表 征

對(duì)TmioTCPP-GPC3-mAb 進(jìn)行FT-IR 表征以確定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，如圖3 所示，3 115 cm-1為卟啉環(huán)上N－H 的伸縮振動(dòng)吸收峰，在與GPC3-mAb 偶聯(lián)之后，被抗體的3 444 cm-1左右O－H 吸收峰所覆蓋，同時(shí)，2 900 cm-1左右出現(xiàn)明顯的直鏈飽和烷烴（－CH2－，－CH3）的吸收峰，1 635 cm-1為酰胺（－CO－NH－）的吸收峰，1 384 cm-1為C－N 面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰，1 200～900 cm-1出現(xiàn)明顯的C－O的伸縮振動(dòng)吸收峰，750～600 cm-1為酰胺（－NH2）的吸收峰。

圖3 TmioTCPP-GPC3-mAb 的FT-IR 譜Fig.3 FT-IR spectra of TmioTCPP-GPC3-mAb

2.3 TmioTCPP-GPC3-mAb 的電化學(xué)性能

通過(guò)循環(huán)伏安法測(cè)定了TmioTCPP-GPC3-mAb的氧化還原性能，如圖4 所示。由圖4 中可以看出，TmioTCPP-GPC3-mAb 的陽(yáng)極電勢(shì)在1.1 V 附近出現(xiàn)，根據(jù)文獻(xiàn)［20］計(jì)算，最高占有分子軌道能量EHOMO、最低占有分子軌道能量ELUMO、能隙Eg分別為-4.5 eV、-5.5 eV和1.1 eV。TmioTCPP-GPC3-mAb與TmioTCPP、FTMIO 的相似的可逆氧化還原峰，其陽(yáng)極電勢(shì)稍有下降，可能是由于接上GPC3-mAb后，其位阻效應(yīng)比較大，這進(jìn)一步證明TmioTCPP成功與抗體GPC3-mAb 偶聯(lián)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并保持了良好的氧化還原性能。

圖4 TmioTCPP-GPC3-mAb：（a）循環(huán)伏安曲線，（b）局部放大圖Fig.4 TmioTCPP-GPC3-mAb：（a）cyclic voltammograms，（b）partial magnification

2.4 TmioTCPP-GPC3-mAb 的熒光性能

圖5 為T(mén)mioTCPP-GPC3-mAb 的熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜。由圖5可知，TmioTCPP-GPC3-mAb的最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)分別在416 nm 和651 nm 處，與TmioTCPP 相比，GPC3-mAb 的加入并未改變其激發(fā)強(qiáng)度，且具有相似的熒光性能，表明TmioTCPP 成功與抗體偶聯(lián)。

圖5 TmioTCPP-GPC3-mAb：（a）熒光激發(fā)光譜，（b）熒光發(fā)射光譜Fig.5 TmioTCPP-GPC3-mAb：（a）fluorescence excitation spectra，（b）fluorescence emission spectra

2.5 TmioTCPP-GPC3-mAb 的EPR 測(cè) 試

圖6 為 水 溶性TmioTCPP-GPC3-mAb 的EPR 測(cè)試圖譜，產(chǎn)物濃度約為1.5×10-10mol/L，EPR 信號(hào)較弱，這可能是由于產(chǎn)品的濃度過(guò)低。

圖6 TmioTCPP-GPC3-mAb 的EPR 譜 圖Fig.6 EPR profile of TmioTCPP-GPC3-mAb

3 結(jié) 論

本文采用Lindsedy 法成環(huán)法等一系列反應(yīng)直接將FTMIO 引入卟啉環(huán)中，合成具有電子順磁性能的水溶性TmioTCPP，再將肝癌靶向基團(tuán)GPC3-mAb 與TmioTCPP 進(jìn)行偶聯(lián)，制備含GPC3 單克隆抗體電子順磁共振成像診斷劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水溶性TmioTCPP-GPC3-mAb 具有與卟啉相似的熒光性能，并保持了FTMIO 的氧化還原性能。GPC3-mAb 是肝癌特征識(shí)別基團(tuán)，且卟啉化合物能較好的富集在腫瘤組織部位，因此有望提高EPR診斷劑對(duì)肝癌的檢測(cè)靈敏度。