重組UK114蛋白對宰后牛肉calpain-1及肌原纖維蛋白特性的影響

宋彩麗，尹淑琴，張曉紅，常泓

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 期刊社，山西 太谷 030801)

肉的色澤、風(fēng)味、嫩度、持水性是決定肉品質(zhì)的主要因素，決定了對視覺的吸引力和感官的可接受性。肌原纖維蛋白作為肉類蛋白的主要成分之一，決定著肉類的風(fēng)味特性和營養(yǎng)價值等，其在加工、貯藏過程中會受到多種因素的影響發(fā)生降解，導(dǎo)致功能特性受到影響，進(jìn)而影響肉類品質(zhì)[1, 2]，大多數(shù)的研究報道認(rèn)為鈣蛋白酶是引起宰后肌原纖維蛋白降解的最主要內(nèi)源酶[3]。

鈣蛋白酶系統(tǒng)，尤其calpain-1在調(diào)節(jié)一些肌纖維蛋白水解過程中起著重要的作用，激活的calpain-1主要通過影響蛋白質(zhì)水解的速率和程度，對肉的嫩度和持水性起主要作用[4]。

馬逸嶠等[5]研究表明，calpain-1參與了羊肉成熟過程中肌原纖維蛋白的降解，尤其是對肌原纖維蛋白中肌間線蛋白(Desmin)和肌鈣蛋白-T(Troponin-T)有降解作用。Pomponio等[6]研究表明，在豬肉宰后成熟過程中，calpain-1活性與肌原纖維蛋白的水解程度成正比。UK114蛋白作為calpain-1的激活蛋白，是由137個氨基酸組成的小蛋白質(zhì)[7]，具有多種生物學(xué)功能，它參與腫瘤生長的抑制、介導(dǎo)細(xì)胞溶解、細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)及嘌呤代謝、伴侶等過程[8～11]。DeMartino和Blumenthal等人[12]的研究表明UK114作為calpain-1的激活劑時，calpain首先與Ca2+結(jié)合，然后UK114再作用于這個復(fù)合體。

肌原纖維蛋白的降解是影響宰后貯藏過程中肉類品質(zhì)變化的主要因素，據(jù)報道對肌原纖維蛋白凝膠影響因素研究較多，如pH、離子強(qiáng)度、添加劑、氧化等方面[13, 14]，在不同物種中也有一些鈣蛋白酶對肌原纖維蛋白降解的研究，但在牛肉中添加鈣蛋白酶激活劑對肌原纖維蛋白降解的研究報道較少。本研究主要通過添加鈣蛋白酶激活劑UK114蛋白，研究UK114蛋白對calpain-1和calpastatin介導(dǎo)的肉樣肌原纖維蛋白特性的影響，以促進(jìn)宰后肌肉calpain-1的激活，為牛肉宰后成熟提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

由文水保賢莊彤輝肉牛養(yǎng)殖場提供體格良好、體重均勻、生理成熟指標(biāo)相似的3～4歲的西門塔爾公肉牛，屠宰后30 min內(nèi)，迅速取背最長肌在4 ℃條件下切割成0.3 cm左右的均勻薄片，錫箔紙包裝置于液氮中運(yùn)回實驗室，-80 ℃貯藏備用。

1.2 主要試劑與儀器

標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker：美國 Thermo 公司，calpain-1、calpastatin：德國Merck公司，過硫酸銨(APS)和N, N′-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)：美國 Sigma 公司，考馬斯亮藍(lán)R-250、丙烯酰胺(Acr)、溴酚藍(lán)、牛血清蛋白、乙二胺四乙酸(EDTA)、Tris和TEMED等均購自北京索萊寶科技有限公司。

Centrifuge cm型小型高速離心機(jī)，Eppenddorf；PY-80 A/S型脫色搖床，江蘇省津塘市榮華儀器有限公司；Testo 206型pH計，得圖(亞洲)有限公司；HB120-S金屬浴，北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司；DYCZ-24DN型垂直電泳槽，北京六一生物科技有限公司；Alpha mini型凝膠成像儀，美國阿爾發(fā)。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設(shè)計

取牛背最長肌，切成0.3 cm左右的均勻薄片置于自封袋，作為對照組，試驗組1、2、3、4分別注射12 μg的 6 g·L-1calpain-1、UK114+calpainv1、calpastatin、UK114+calpastatin，每組重復(fù)注射3個樣品，在4 ℃冰箱分別孵育1，12，24，48，72，120，168 h，然后測定各項理化指標(biāo)。

1.3.2 肌肉中calpain-1活性測定

參考Melody等[15]測定calpain-1活性的方法并作調(diào)整。稱取2 g肉樣(去除結(jié)締組織)，加6 mL預(yù)冷提取液(pH 8.3、100 mmol·L-1Tris-HCl，0.05% β-巰基乙醇，10 mmol·L-1EDTA)，4 ℃高速勻漿充分，8 000×g冷凍離心30 min，取上清，考馬斯亮藍(lán)法測定鈣蛋白酶濃度。加入等體積的樣品處理液(pH 6.8、150 mmol·L-1Tris-HCl，0.02%溴酚藍(lán)，0.75% β-巰基乙醇，20%甘油)，置于-80 ℃冰箱備用。采用4%的濃縮膠和12.5%的分離膠，蛋白上樣量為30 μg。電泳完成后，將膠置于孵育液(pH 7.5、50 mmol·L-1Tris-HCl，5 mmol·L-1氯化鈣，0.1%MCE)反應(yīng)1 h，期間更換3次反應(yīng)液，繼續(xù)孵育16 h，考馬斯亮藍(lán)染色，過夜脫色。

1.3.3 提取肌原纖維蛋白

參考Doerscher等[16]的方法并略作修改。將剔除脂肪和結(jié)締組織的肉樣絞碎，加入4倍體積的提取緩沖液(100 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1EDTA，pH 8.3)，勻漿搗碎，1000×g離心20 min。沉淀用4倍體積的標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液(standard salt solution，SSS)(100 mmol·L-1KCl，20 mmol·L-1K2HPO4/KH2PO4，pH 7.0，2 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1EGTA)懸浮沖洗3次，1 500×g離心10 min。沉淀溶解于100 mmol·L-1KCl和5 mmol·L-1Tris溶液，置于-20 ℃冰箱備用。

1.3.4 肌原纖維小片化指數(shù)(MFI)的測定

參考Culler等[17]的方法并稍作改進(jìn)。取4 g肉樣，加入40 mL預(yù)冷MFI緩沖液(100 mmol·L-1KCl, 8.8 mmol·L-1KH2PO4, 1 mmol·L-1EGTA, 11.2 mmol·L-1K2HPO4,1 mmol·L-1MgCl2, 1 mmol·L-1NaN3)，冰浴20 s，2 ℃ 4 000 r·min-1勻漿離心15 min，去上清，加5×體積的MFI緩沖液懸浮沉淀，過濾去除結(jié)締組織和脂肪，用雙縮脲法測定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)節(jié)到0.5 g·L-1，分光光度計測定540 nm波長吸光度值A(chǔ)540，通過下列公式計算MFI值：

MFI=A540×200

1.3.5 肌原纖維蛋白表面疏水性的測定

參考Chelh等[18]的方法并稍加改進(jìn)。在試驗組1、2、3、4孵育的肌原纖維蛋白中加入pH 6.0、20 mmol·L-1的磷酸鹽溶液，稀釋蛋白濃度為5 g·L-1。取2 mL蛋白溶液加入1 g·L-1的溴酚藍(lán)溶液400 μL，室溫攪拌10 min，4 000×g離心15 min，上清液稀釋10倍后，595 nm處測吸光度A。空白為不加樣的磷酸鹽緩沖液。計算公式為：

溴酚藍(lán)(μg)=200(A空白-A樣品)/A空白

1.3.6 肌原纖維蛋白溶解度的測定

參考李文采等[19]的方法并稍加調(diào)整。在試驗組1、2、3、4的肌原纖維蛋白中加600 mol·L-1磷酸緩沖溶液，將蛋白濃度稀釋為6 g·L-1，震蕩混勻。4 ℃冰箱放置10 h，7300×g離心15 min，取上清，測定蛋白溶液濃度，通過下列公式計算：

蛋白溶解度(%)=(上清蛋白濃度/原液蛋白濃度)×100%

1.3.7 SDS-PAGE凝膠電泳

參考Laemmil[20]的方法并稍作調(diào)整。濃縮膠和分離膠的濃度分別為4%和12%，取約5 g肌原纖維蛋白，12 000 r·min-1離心10 min，取上清20 μL上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。將電壓設(shè)定70 V，電泳30 min后調(diào)到120 V恒壓，電泳結(jié)束后考馬斯亮藍(lán)R-250染色，過夜脫色后在成像儀進(jìn)行觀察。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS軟件對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，使用最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)；使用Excel軟件繪制圖表，結(jié)果表示為：“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”。

2 結(jié)果與分析

2.1 宰后calpain-1活性變化

采用活性電泳法測定各組孵育不同時間calpain-1活性，如圖1可見：隨著孵育時間的延長，對照組條帶的亮度逐漸減弱，72 h后無明顯條帶，說明calpain-1活性幾乎消失；添加calpain-1組條帶減弱變緩，120 h后無清晰條帶；UK114+calpain-1組1 h時就有微弱條帶，說明UK114可促進(jìn)calpain-1的激活；與對照組相比，添加calpastatin組72 h時條帶最清晰，表明加入calpastatin抑制了calpain-1的活性，使其在1～48 h內(nèi)活性很低。與calpastatin處理組相比，UK114+calpastatin組在48 h有明顯條帶，calpain-1活性上升。

圖1 宰后孵育不同時間calpain-1活性變化

2.2 宰后肌原纖維小片化指數(shù)的變化

肌原纖維小片化指數(shù)(MFI)的大小可以反應(yīng)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)完整性的破壞程度[21]，MFI越大，肌原纖維蛋白被降解程度越大。由圖2可見：宰后孵育過程中，肌原纖維小片化指數(shù)總體呈上升趨勢。對照組和calpain-1處理組隨著孵育時間延長，上升差異顯著(P<0.05)；對照組在72～120 h時顯著上升(P<0.05)，UK114+calpain-1組12～72 h顯著上升(P<0.05)，之后上升緩慢，說明UK114可以促進(jìn)calpain-1對肌原纖維蛋白的降解，MFI增大；calpastatin處理組與其他組相比整體上升緩慢，但也存在顯著差異(P<0.05)。UK114+calpastatin組48～72 h MFI指數(shù)增加最多，從53.07升到62.91，上升最快期與對照組相比有所提前，說明UK114可以降低calpastatin對肌原纖維蛋白降解的抑制作用。

2.3 宰后孵育不同時間肌肉中肌原纖維蛋白的SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE凝膠電泳分析宰后孵育不同時間肌肉中肌原纖維蛋白降解情況，由圖可見，隨著孵育時間延長，部分條帶模糊甚至幾乎消失，說明這些蛋白發(fā)生了降解。如圖3～圖5中，從上到下主要條帶分別為220 kDa的肌球蛋白重鏈，100 kDa的α-輔肌動蛋白，43 kDa左右的肌動蛋白和23 kDa的肌球蛋白輕鏈1。如圖3對照組中1～72 h蛋白條帶幾乎無差異，120 h后蛋白開始降解。

由圖4可見，與calpain-1處理組相比，UK114+calpain-1組48～168 h條帶整體變淺，在72 h時，UK114+calpain-1組中蛋白條帶明顯弱于calpain-1組，表明UK114可加強(qiáng)calpain-1對肌原纖維蛋白的降解，小片化指數(shù)升高。

圖5為calpastatin處理組和UK114+calpastatin處理組肌原纖維蛋白變化圖，與對照組相比，calpastatin組1～120 h條帶無明顯差異，168 h時條帶變?nèi)酰f明加入calpastatin抑制了肌原纖維蛋白的降解；UK114+calpastatin組72 h后條帶逐漸變淺，與calpastatin組相比，72 h降解程度較大。以上結(jié)果表明calpain-1對肌球蛋白和肌動蛋白均可以降解。

2.4 肌原纖維蛋白表面疏水性的變化

蛋白質(zhì)的表面疏水性可以反映蛋白結(jié)構(gòu)的聚集程度，還可以衡量蛋白質(zhì)變性程度。如圖6所示，肌肉在不同條件孵育過程中肌原纖維蛋白表面疏水性先上升后下降，但總體呈增加的趨勢。孵育初期處理組的疏水性都上升，其中UK114+calpain-1處理組上升具有顯著差異(P<0.05)，其他處理組上升均不顯著(P>0.05)；對照組在72 h時表面疏水性最高，結(jié)合溴酚藍(lán)的量為23.51 μg，顯著高于其他時間；UK114+calpain-1處理組在24 h表面疏水性達(dá)到最高值，隨后顯著下降；calpastatin組在120 h時表面疏水性最高，達(dá)到了24.99；1～24 h均存在上升，但差異不顯著(P>0.05)，而24～120 h升高具有顯著差異。疏水性降低原因可能是calpain-1降解肌原纖維蛋白，導(dǎo)致蛋白解鏈速度大于其聚集速度，使蛋白質(zhì)中的極性分子暴露，疏水性殘基包埋，造成疏水性短暫下降。

a-b-c表示同一處理組不同時間點(diǎn)差異顯著(P<0.05)。下同

M：Maker；孵育時間分別為1，12，24，48，72，120，168 h。下同

Maker的左側(cè)為calpain-1處理組，右側(cè)為UK114+calpain-1

Maker的左側(cè)為calpastatin處理組，右側(cè)為UK114+calpastatin處理組

2.5 肌原纖維蛋白溶解度的變化

蛋白溶解度是衡量蛋白質(zhì)變性和聚集的一種方法，蛋白結(jié)構(gòu)的改變會影響溶解度，蛋白溶解度與其親水性呈正相關(guān)，良好的蛋白溶解度是其發(fā)揮功能特性的前提。如圖7所示，由于肌肉宰后存在僵直現(xiàn)象，在不同條件孵育過程中肌原纖維蛋白溶解度呈先下降后上升的趨勢。宰后孵育1 h各組之間的溶解性幾乎沒有差異，孵育1～24 h，各組之間都顯著下降(P<0.05)；對照組在72 h溶解性最低，與其他時間存在顯著差異(P<0.05)，72～168 h溶解性顯著上升；添加calpain-1組在48 h溶解度最低，為85.49，和對照組最低時差異不顯著，提前結(jié)束了僵直期；UK114+calpain-1處理組在24 h時溶解度達(dá)到最小值，隨后上升，24 h和其余孵育時間都存在顯著性差異(P<0.05)；Calpastatin組的溶解性在1～120 h都在下降，下降差異顯著(P<0.05)，在120 h和168 h時溶解度極顯著低于其他組，說明加入calpastatin后影響了肌原纖維蛋白的降解速度；UK114+calpastatin組的溶解性在48 h后開始上升，可能是由于UK114與calpastatin競爭性地、在同一位點(diǎn)與calpain結(jié)合，從而減弱了calpastatin的抑制作用。

圖6 宰后孵育不同時間肌原纖維蛋白表面疏水性的變化

圖7 宰后孵育不同時間肌原纖維蛋白溶解度的變化

3 討論與結(jié)論

肌原纖維蛋白是牛肉中含量最高的蛋白質(zhì)，在牛肉宰后加工、貯藏和運(yùn)輸中會發(fā)生不同程度降解，進(jìn)而改變?nèi)獾钠焚|(zhì)，calpain-1是引起宰后肌原纖維蛋白降解的最主要內(nèi)源酶[3]。動物宰后ATP減少，pH降低，肌質(zhì)網(wǎng)的鈣泵功能發(fā)生崩解，釋放Ca2+，鈣離子濃度升高，激活calpain-1[22]。對照組牛肉在宰后4 ℃貯存期間，calpain-1活性在48 h后幾乎消失，可能是由于calpain-1自溶作用增強(qiáng)和Ca2+濃度下降。He等[23]研究發(fā)現(xiàn)，魚肉中calpain-1在宰后5 h活性最高，之后迅速下降；Lee等[24]報道，雞calpain-1活性在6 h之后幾乎消失。

Koohmaraie等[25]報道，屠宰后24 h牛肉中calpain-1的活性下降了50%，與本研究對照組結(jié)果一致。說明不同物種宰后不同時間calpain-1活性不同，而影響calpain-1活性的主要因素是UK114和calpastatin。

UK114+calpain-1組與只添加calpain-1組相比，前者calpain-1在1 h活性較低，在12 h活性明顯增強(qiáng)，說明UK114能顯著提高calpain-1的活性；Melloni等人[26]報道，UK114是calpain-1的激活劑，通過改變蛋白酶構(gòu)象，降低calpain-1激活所需的Ca2+濃度而發(fā)揮作用。添加calpastatin后calpain-1在48 h內(nèi)活性較低，而UK114+calpastatin組中calpain-1的活性在48 h很高，說明UK114蛋白可以減弱calpastatin的抑制作用。此抑制現(xiàn)象的發(fā)生可能由于UK114蛋白與calpastatin競爭性地、在同一位點(diǎn)與calpain-1結(jié)合[27]，本結(jié)果與He等人的研究結(jié)果一致。

肌原纖維蛋白的表面疏水性和溶解性決定了其水合特性。本研究通過測定肌原纖維蛋白的表面疏水性，發(fā)現(xiàn)其隨孵育時間總體呈增大趨勢，這一研究結(jié)果與惠小洋[28]等的研究結(jié)果一致。前期升高的原因可能是宰后初期，蛋白質(zhì)氧化程度低，表面疏水性殘基逐漸暴露出來。隨著孵育時間的延長，calpain-1活性升高，蛋白降解增強(qiáng)，使疏水性殘基包埋，親水性基團(tuán)暴露，疏水性下降。添加UK114+calpain-1后蛋白表面疏水性開始下降的時間比對照組和只添加calpain-1組均提前，極值點(diǎn)提前到24 h，而添加UK114+calpastatin后疏水性上升的時間延長，原因可能是UK114不僅對calpain-1降解肌原纖維蛋白有促進(jìn)作用，對calpastatin的活性也有一定的抑制作用。

UK114蛋白可通過促進(jìn)calpain-1的激活，以及影響calpastatin的抑制作用，從而促進(jìn)宰后牛肉肌原纖維蛋白的降解。隨著孵育時間的延長，calpain和UK114+calpain處理組疏水性和溶解性的極值點(diǎn)分別提前到48 h和24 h；calpastatin處理組疏水性和溶解性的極值點(diǎn)推遲到120 h；但UK114+calpastatin處理組在48 h達(dá)到極值點(diǎn)。可見UK114蛋白可通過影響calpain-1和calpastatin對肌原纖維蛋白的降解作用，影響肌原纖維蛋白的溶解性，改善疏水性，為后續(xù)研究牛肉的成熟嫩化提供一種新途徑。