一氧化氮影響植物不定根發(fā)生的研究進展

李維芳，王春蕾，王 妮，鄧雨正，姚彥東，魏麗娟，廖偉彪

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，甘肅 蘭州 730070)

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種水溶性和脂溶性的氣體小分子，作為一種重要的信號分子，一直是生命科學領域研究的熱點。NO在打破種子休眠[1]、抑制下胚軸伸長[2]、延緩葉片衰老[3]、緩解非生物脅迫[4]等方面發(fā)揮著重要的作用。

不定根是由非根組織形成的根，由分化的細胞發(fā)育而來[5]。不定根的發(fā)生主要有誘導階段、啟動階段和表達階段等三個階段[6]。誘導階段包括不定根起源細胞響應內(nèi)外刺激，水解淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖為啟動階段提供能量，在該階段PrSCL1和PrSHR基因表達顯著上調(diào)，參與下胚軸不定根的誘導[7]。啟動階段包括起始細胞開始分裂形成分生組織及根原基，啟動階段劃分5個部分：(1)建立不定根表皮-內(nèi)皮層、中柱和根冠起始細胞；(2)起始細胞通過平周分裂形成不定根表皮、內(nèi)皮層和中柱；(3)內(nèi)皮層通過平周分裂形成皮層；(4)根冠起始細胞通過平周分裂形成柱細胞，不定根原基的穹頂狀結(jié)構(gòu)建成；(5)中柱基部的細胞伸長(圖1)[8]。在擬南芥中，形成層及其周圍薄壁細胞中積累的生長素誘導基因WOX11(WUSCHELRelatedHomeobox11)和WOX12的表達會上調(diào)LBD16(Lateralorganboundariesdomain16)和LBD29基因表達，從而介導形成層細胞轉(zhuǎn)變?yōu)椴欢ǜ鹗技毎?，之后再轉(zhuǎn)變?yōu)椴欢ǜ毎鸞9]。表達階段包括不定根原基生長突破表皮層，新形成的不定根與維管束相連。在表達階段，OsCAND1通過參與不定根原基生長素信號維持G2/M細胞周期的轉(zhuǎn)化來控制不定根的伸長[10]。OsWOX11與ERF3互作增強細胞分裂素信號通路，從而促進不定根的伸長[11]。在植物正常生長過程中，不定根的形成是植物正常發(fā)育的一部分，是自然發(fā)生的。對于大多數(shù)單子葉植物而言，不定根是植物主要的根系統(tǒng)，而在許多雙子葉植物中，不定根的形成是通過生殖生長來完成的[5]。此外，植物莖或葉受到脅迫或激素等影響也可以產(chǎn)生不定根[12]。而且，不定根是植物吸收水分、營養(yǎng)元素以及存儲同化物的重要器官[13]。在營養(yǎng)繁殖以及利用無性繁殖獲取優(yōu)良品種[14]等方面都有不定根的參與。因此，不定根的研究對調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育有很重要的意義。

目前關于NO在植物(如萬壽菊[15-16]、黃瓜[17-19]、綠豆[20]等)不定根發(fā)生中的作用已有較多報道。研究表明，NO對植物不定根發(fā)生起到了非常重要的作用。因此，本文主要對植物中NO的生物合成途徑以及不定根形成過程中NO發(fā)揮的作用進行系統(tǒng)的回顧和總結(jié)，以期對NO的生物合成途徑和NO在植物不定根中的作用有一個更深的理解。

1 NO在植物體中的產(chǎn)生

在植物體內(nèi)NO的產(chǎn)生是一個相對復雜的過程，目前對NO產(chǎn)生途徑的研究相當有限。現(xiàn)在普遍認為，在植物體內(nèi)NO的合成途徑主要有兩種：酶促合成途徑和非酶促合成途徑[21](表1)。但是，目前這兩個種途徑中的一些酶的作用和氧化還原機理需要進一步驗證和研究。本文結(jié)合最近幾年有關NO在植物體中產(chǎn)生途徑的研究進行闡述。

1.1 酶促合成途徑

1.1.1 硝酸還原酶(nitrate reductase， NR)途徑

NR途徑是由硝酸還原酶催化的NO合成途徑。硝酸還原酶存在于綠藻和種子植物的細胞溶膠[22]，被認為是植物體中產(chǎn)生NO最主要的途徑[23]。在擬南芥保衛(wèi)細胞中首次發(fā)現(xiàn)NR是由NIA1和NIA2同源基因編碼[24]。通過對個體和突變體的比較研究發(fā)現(xiàn)，在不同的植物組織中NO的合成量不同[25-26]。NR是以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADH)為電子供體，主要催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[27]，也可以催化亞硝酸鹽還原為NO。該反應需要少量的氧自由基、光照和高濃度的亞硝酸鹽。但是，這種反應的效率很低[28]，僅為硝酸鹽還原的1%[23]。而且，在低氧環(huán)境中需要亞硝酸鹽水平超過天然硝酸鹽底物水平[29]。此外，NR可通過調(diào)節(jié)電子流直接調(diào)控催化亞硝酸鹽生成NO的過程，或者通過影響亞硝酸鹽濃度來間接控制NO產(chǎn)生[30]。

a，莖形成層；b，不定根表皮；c，內(nèi)皮層；d，皮層；e，后生木質(zhì)部；f，根冠分生組織；g，不定根原基；h，莖表皮。 a， Stem cambium; b， Adventitious root epidermis; c， Endodermis; d， Cortex; e， Metaxylem; f， Root cap meristem; g， Adventitious root primordium; h， Stem epidermis.圖1 植物不定根的形成過程Fig.1 The formation of adventitious roots in plants

1.1.2 NO合酶(nitric oxide synthase， NOS)途徑

NOS途徑首先是在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的。在哺乳動物中，NO是通過NO合酶(NOS)的氧化機制合成的，NO合酶有內(nèi)皮細胞NOS(endothelial eNOS)、神經(jīng)細胞NOS(neuronal nNOS)和誘導型NOS(inducible NOS，iNOS)三種類型[31]。Crawford等[32]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一種名為AtNOS1的NOS編碼基因，AtNOS1可能與NO的合成或積累有直接或間接的關系，所以有研究者建議將AtNOS1改為AtNOA1[32]。通過檢測發(fā)現(xiàn)AtNOS1似乎具有將L-精氨酸 (L-Arginine， L-Arg)轉(zhuǎn)化為L-瓜氨酸的能力，但是后來的研究者無法檢測到由L-Arg轉(zhuǎn)化為L-瓜氨酸[33]。在高等植物中純化的AtNOS1蛋白可與L-Arg產(chǎn)生NO和瓜氨酸(表1)，且動物NOS抑制劑顯著降低了這種蛋白的活性[33]。因此，目前植物體中是否存在與哺乳動物NOS在結(jié)構(gòu)上類似的基因還存在爭議。研究發(fā)現(xiàn)，在高等植物中可能存在L-Arg、多胺或羥胺等被氧化生成NO的氧化機制[23]。而且可能發(fā)生在整個細胞環(huán)境中，包括細胞質(zhì)、線粒體、葉綠體、過氧化物酶體和質(zhì)外體[32]。后來，研究者在綠色鞭毛藻(Ostreococcuslucimarinus)中發(fā)現(xiàn)一種蛋白，該蛋白與哺乳動物的NOS有45%的相似性，該酶在體外表現(xiàn)出NOS活性，與動物NOS蛋白具有相似的性質(zhì)[34]。因此，該蛋白被稱為NOS-like酶。

1.1.3 其他酶促合成途徑

在植物體中還存在其他NO的合成途徑，黃嘌呤氧化還原酶(xanthine oxidoreductase，XOR)途徑是植物體合成NO的一個重要途徑。XOR分為黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)和黃嘌呤脫氫酶(xanthine dehydrogenase，XDH)，其主要形式是XOD，XDH只有30%[35]。XOR含有鉬原子、黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)和兩個鐵硫氧化還原中心[36]，XOR作為一種含鉬酶，擁有低氧條件下催化亞硝酸鹽還原為NO的能力[37](表1)。葉綠體中，在亞硝酸鹽和還原性底物存在的條件下，XOR催化亞硝酸鹽和還原性底物生成NO[38]。此外，Maia等[39]研究發(fā)現(xiàn)，氧氣濃度的變化會微調(diào)XOR催化NO的生成，在FAD和氧氣充足的條件下，XOR可產(chǎn)生超氧陰離子自由基進行細胞間的信息交流。

在煙草中發(fā)現(xiàn)的一種根特異性質(zhì)膜結(jié)合亞硝酸鹽NO還原酶(nitrite NO reductase，Ni-NOR)也可以催化底物合成NO。該酶利用細胞色素c作為體外電子供體催化煙草中的亞硝酸鹽還原為NO[40](表1)。而且，Ni-NOR活性可能會受到氧氣濃度的調(diào)控，但是Ni-NOR活性僅限于植物的根部[41]。后來，也有研究者認為Ni-NOR可能參與植物根的生長過程[42]。但是Ni-NOR的身份需進一步研究確定。

1.2 非酶促合成途徑

在植物體中除了上述生物酶促途徑合成NO以外，還可以通過非酶促途徑合成。Cooney等[43]首先發(fā)現(xiàn)：在光照條件下，類胡蘿卜素可與NO2反應，生成NO。后來，Wang等[44]發(fā)現(xiàn)酸性條件下，通過抗壞血酸(ascorbic acid，ASA)以及其他還原劑的作用，質(zhì)外體可以釋放NO(表1)。酸性條件下，赤霉素(gibberellic acid，GA)和脫落酸(abscisic acid，ABA)處理的大麥普通糊粉層中，還原劑可以將NO-2還原為NO[45](表1)。在缺氧或低氧條件下，植物的線粒體消耗NADH，將亞硝酸鹽還原為NO[46](表1)。此外，羥胺類(R-NHOH)也可被超氧化物或H2O2氧化，在煙草細胞懸浮液中釋放出NO[47](表1)，因此，非酶促途徑NO的合成可能與氮氧化物與植物代謝產(chǎn)物之間的化學反應以及酸性條件下亞硝酸根(NO-2)的氧化還原反應有關[48]。此外，水楊酸和H2O2可誘導伴生細胞產(chǎn)生NO[49]，但是該氧化反應效率較低且反應的生理條件和作用都尚不清楚。

2 NO對植物不定根發(fā)生的影響

植物的生長發(fā)育、代謝等生命活動都是通過復雜的機制來協(xié)調(diào)完成的。植物不定根的發(fā)生也受到很多因素影響，如：光照[50]、水分[51]、營養(yǎng)物質(zhì)[52]、機械脅迫[53]等因素都會影響不定根發(fā)生。而NO作為一種簡單的氣體分子，在植物中的作用受到了廣泛的關注，尤其是在植物不定根發(fā)生中扮演著至關重要的角色。

2.1 植物不定根發(fā)生過程中NO的產(chǎn)生

NO處理綠豆下胚軸后，NO清除劑2-4-羧基苯基-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-氧-3-氧化物鉀鹽(2，4-carboxyphenyl-4，4，5，5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide， cPTIO)和NOS-Like抑制劑 NG-硝基1-氨甲酯(NG-nitro-l-Arg-methyl ester， L-NAME)處理都抑制了綠豆不定根發(fā)生[54]，且檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)源NO減少。因此，在不定根中NO的產(chǎn)生可能通過NOS-Like途徑來完成[54]，后來Xuan等[55]在黃瓜下胚軸不定根發(fā)生中，使用 L-NAME和鎢酸鹽(Na2WO4)(NR抑制劑)探究NO的來源。發(fā)現(xiàn)L-NAME處理后的黃瓜幼苗中NO內(nèi)源含量減少，因此，在不定根發(fā)生過程中產(chǎn)生的NO可能是NOS-Like途徑合成的。而Na2WO4處理后的黃瓜幼苗NO含量沒有顯著變化。所以黃瓜不定根中NO的產(chǎn)生并非NR途徑產(chǎn)生。但是，在向日葵不定根發(fā)生的研究中，NO產(chǎn)生有NOS和NR兩種途徑[56]。

2.2 NO調(diào)控不定根發(fā)生的機理

2.2.1 木質(zhì)素參與NO調(diào)控的不定根發(fā)生

NO在調(diào)控不定根的發(fā)生過程中，木質(zhì)素也在其中發(fā)揮著作用。NO供體硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)濃度較低時可誘導綠豆不定根發(fā)生，同時增加總木質(zhì)素含量，改變參與木質(zhì)素生物合成的過氧化物酶(peroxidase，POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)的活性[57]。在SNP濃度較高的情況下，不定根發(fā)生和木質(zhì)化下降[58]。利用清除劑cPTIO清除內(nèi)源NO后，下胚軸不定根發(fā)生和木質(zhì)素合成酶活性顯著下降。這說明NO對根系木質(zhì)化的促進作用可能與NO自身有關[57]。不定根發(fā)生過程中，NO引起木質(zhì)素生物合成酶活性的變化導致木質(zhì)素水平的變化，進而影響不定根的發(fā)生[57]。100 μmol·L-1SNP處理后的紫錐菊外植體內(nèi)酚類化合物、黃酮類化合物和咖啡酸衍生物等次生代謝物的積累增加[58]，而且相同濃度的SNP還可以增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbic acid peroxidase，APX)活性，進而誘導抗氧化防御[58]。

2.2.2 抗氧化酶參與NO調(diào)控的不定根發(fā)生

目前已知NO能緩解植物干旱脅迫[59]、鹽脅迫[60]等非生物脅迫，而在植物生長發(fā)育過程中，非生物脅迫會對不定根發(fā)生產(chǎn)生影響。在鎘脅迫下，NO可以緩解鎘對綠豆下胚軸不定根的抑制作用，同時提高了內(nèi)源NO水平和谷胱甘肽(glutathione，GSH)、ASA、多酚和脯氨酸(proline，Pro)的水平，降低了丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量[61]。POD、過氧化氫酶(catalase，CAT)、SOD和吲哚乙酸氧化酶(indoleacetic acid oxidase，IAAO)等抗氧化酶活性的提高可以逆轉(zhuǎn)鎘脅迫，說明NO調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)防止膜脂過氧化在不定根發(fā)生中的應激反應，緩解鎘脅迫對不定根的抑制作用，進而促進綠豆不定根的發(fā)生[61]。在干旱脅迫下，NO可促進萬壽菊不定根的發(fā)生，而且存在明顯的劑量依賴效應[16]。此外，NO還能減輕干旱脅迫對葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的破壞，同時提高葉片葉綠素的含量和下胚軸可溶性碳水化合物和蛋白質(zhì)的含量，降低淀粉含量[16]。因此，在植物緩解非生物脅迫過程中，NO影響抗氧化酶活性進而調(diào)控植物不定根的發(fā)生。

表1 植物體內(nèi)NO的合成途徑

Table 1 Synthetic pathway of NO in plants

合成途徑Synthetic pathway底物Substrate酶/反應條件Enzyme/reaction conditions基因Gene合成部位Site of synthesis參考文獻Reference酶促合成途徑NO-2NRNIA1、NIA2細胞質(zhì)Cytoplasm[24]、[27]Enzymatic synthesisL-ArgNOSAtNOS1(AtNOA1)線粒體Mitochondria[31]pathwayL-ArgNOS-like—葉綠體Chloroplast[32-34]NO-2XOR—葉綠體Chloroplast[37]NO-2Ni-NOR—根部線粒體Mitochondria of root[41]非酶促合成途徑NO-2光照Illumination—葉綠體Chloroplast[43]Non-enzymaticASC 缺氧Anoxia、H+質(zhì)外體Apoplast[44]synthesis pathwaysNO-2H+、GA、ABA—糊粉層Aleurone layer[45]NO-2、NADH缺氧或低氧Hypoxia—線粒體Mitochondria[46]R-NHOHH2O2—未知Unknown[47]SAH2O2—伴胞Companion cell[49]

NR，硝酸還原酶；L-Arg，L-精氨酸；XOR，黃嘌呤氧化還原酶；Ni-NOR，亞硝酸鹽NO還原酶；R-NHOH，羥胺；NOS，NO合酶；SA，水楊酸。

NR， Nitrate reductase; L-Arg， L-arginine; XOR， Xanthine oxidoreductase; Ni-NOR， Nitrite:NO reductase; R-NHOH， Hydroxylamine; NOS， Nitric oxide synthase; SA， Salicylic acid.

2.2.3 細胞周期基因參與NO調(diào)控的不定根發(fā)生

在植物不定根發(fā)生過程中，Xuan等[62]發(fā)現(xiàn)CsDNAJ-1可能接受生長素信號或周圍刺激調(diào)節(jié)細胞分裂和分化。SNP處理后，黃瓜幼苗中CsDNAJ-1的基因表達上調(diào)[63]，而且與觀察到不定根的數(shù)目和長度相匹配，進一步添加NO清除劑和抑制劑后，該基因的表達受到抑制。因此，Zhu等[63]推測CsDNAJ-1在不定根發(fā)生過程中的表達可能需要NO的參與。細胞分裂伴隨細胞周期的變化，CycA和CycB編碼兩種類型的細胞周期蛋白參與調(diào)控細胞分裂過程[63]。在Zhu等[63]的研究中，NO和富氫水(hydrogen rich water，HRW)處理可以上調(diào)黃瓜幼苗中CycA和CycB的表達，促進細胞周期中G1期到S期的轉(zhuǎn)化。CDKA和CDKB基因的表達在NO和HRW處理后也出現(xiàn)不同程度上調(diào)。NO在HRW誘導的不定根發(fā)生中，NO通過CycA、CycB、CDKA、CDKB等基因的調(diào)控，促進細胞分裂，進而促進不定根的形成[62]。

3 一氧化氮與植物激素互作對植物不定根發(fā)生的影響

植物激素是植物自身產(chǎn)生的一類有機物，參與了植物全部的生長發(fā)育過程。目前，不定根發(fā)生過程中，植物激素參與的研究主要有吲哚-3-乙酸(indolebutyric acid，IAA)、乙烯 、萘乙酸(naphthylacetic acid，NAA)等物質(zhì)。

3.1 NO與生長素

生長素啟動了細胞分裂和原基形成過程，誘導細胞去分化形成頂端分生組織，所以生長素在不定根發(fā)生中的作用尤為重要，而生長素在不定根發(fā)生過程中往往有NO的參與。前人發(fā)現(xiàn)，SNP促進IAA缺失外植體不定根的發(fā)生，而NO特異清除劑cPTIO能抑制SNP的作用[64]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)作為誘導黃瓜不定根路徑中與細胞分裂相關的酶，參與了NO和IAA促進黃瓜不定根發(fā)生的過程，而NO在該過程中激活MAPK起關鍵的作用(圖2)，該過程通過影響MAPK的活性促進黃瓜不定根發(fā)生[65]。在萬壽菊中，吲哚丁酸(1H-indole-3-butanoic acid，IBA)能引起外植體內(nèi)源NO和H2O2增加；阻斷內(nèi)源生長素運輸后，外源NO、H2O2，IBA仍對不定根的發(fā)生有促進作用。在IBA誘導萬壽菊不定根發(fā)生中，H2O2可能在NO的下游促進不定根的發(fā)生[15](圖2)。SNP處理綠豆下胚軸時呈現(xiàn)明顯的濃度依賴效應，低濃度處理促進不定根數(shù)增加，而超過一定的濃度后，不定根的根數(shù)隨著SNP濃度的增加而減少。而且增加NAA處理后，NAA可以促進NOS途徑中NO的產(chǎn)生，因此，SNP與NAA共同處理的效果要比單獨處理顯著，但加入cPTIO會顯著抑制不定根的發(fā)生[20]。

褪黑素通過NO調(diào)控與生長素相關基因促進不定根的發(fā)生[66]。PIN1負責調(diào)控生長素轉(zhuǎn)運，在NO存在的條件下，褪黑素促使生長素從下胚軸維管束細胞橫向運輸?shù)街兄始毎写龠M不定根發(fā)生[67]。PIN3決定生長素流出的方向，控制生長素的不對稱積累和差異生長，PIN3將生長素重新分配到中柱鞘細胞，同時在中柱鞘細胞中檢測到累積的NO[68]，所以PIN3的表達可能受到NO的調(diào)控。此外，褪黑素提高了PIN7的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而促進下胚軸的伸長[66]。

3.2 NO與乙烯

作為一種氣體植物激素，乙烯在植物體不定根發(fā)生中發(fā)揮著一定的作用。外源乙烯可以提高植物體內(nèi)NR和NOS的活性，從而使內(nèi)源NO產(chǎn)生增多[17]。另外，乙烯可提高與NR和NOS相關基因的表達量，增加黃瓜外植體內(nèi)源NO的含量，而且乙烯可上調(diào)DNAJ-like基因(CsDNAJ-1)和鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase，CDPK)基因(CsCDPK1和CsCDPK5)等與不定根發(fā)生相關基因的表達誘導黃瓜不定根的發(fā)生[17]。在萬壽菊中可以得到相似的結(jié)論，施加外源乙烯提高了萬壽菊NR和NOS活性，增加內(nèi)源NO的積累[18]。此外，乙烯處理后IAAO、POD和PPO活性顯著提高[18]。細胞周期激活后，細胞分裂開始進行，對不定根發(fā)生有很好的促進作用。Jin等[18]發(fā)現(xiàn)，NO參與乙烯誘導的細胞周期激活促進不定根的發(fā)生。目前，外源乙烯是影響內(nèi)源NO的含量來誘導植物不定根產(chǎn)生，且可通過促進細胞周期誘導不定根產(chǎn)生。但是，植物體自身也會產(chǎn)生乙烯，外源乙烯的施加是否影響植物體內(nèi)源乙烯的產(chǎn)生，目前沒有相關研究說明。

3.3 NO與其他激素

除了生長素和乙烯外，褪黑素處理番茄幼苗下胚軸能促進其不定根發(fā)生，且存在明顯的濃度依賴效應。褪黑素下調(diào)S-亞硝基谷胱甘肽還原酶(S-nitroso glutathione reductase，GSNOR)和上調(diào)NR促進內(nèi)源NO積累[66](圖2)。然而，在下胚軸中內(nèi)源NO增加也會促進褪黑素積累[66]。因此，褪黑素和NO在番茄不定根的發(fā)生中協(xié)同發(fā)揮作用。在整個植物不定根發(fā)生過程中，褪黑素和NO在其中發(fā)揮著重要作用，但是目前的相關研究較少，無法確定褪黑素和NO在不定根中具體功能和作用。

4 NO與非激素信號分子互作對植物不定根發(fā)生的影響

4.1 NO與Ca2+

細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化是植物各種細胞過程中的轉(zhuǎn)導信號[69-70]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+在植物不定根發(fā)生中與NO之間有著某些聯(lián)系。NO和生長素誘導黃瓜不定根發(fā)生過程中Ca2+作為第二信使參與激活CDPK活性[70](圖2)。在干旱條件下，Ca2+參與NO調(diào)控SOD、CAT和APX等抗氧化酶活性，逆轉(zhuǎn)干旱脅迫對黃瓜不定根的抑制作用(圖2)，促進不定根發(fā)生[70]。與此同時，在李春蘭等[71]的研究中也得到了相同的結(jié)論：在NO誘導黃瓜下胚軸不定根發(fā)生中，CaCl2提高抗氧化酶活性緩解干旱脅迫對黃瓜不定根發(fā)生的影響。另外一篇報道也說明了Ca2+和鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)在NO和H2O2誘導不定根的信號中發(fā)揮作用，而且進一步推測出了Ca2+和CaM都是NO和H2O2誘導的不定根過程中的下游信號分子[16]。而在滲透脅迫下，外源NO和Ca2+通過保護光合系統(tǒng)、刺激抗氧化系統(tǒng)促進黃瓜不定根發(fā)生；而且在滲透脅迫下，黃瓜不定根的細胞內(nèi)Ca2+含量也隨著NO的增加而增加，施加cPTIO、硝酸還原酶抑制劑Na2WO4和疊氮化鈉(NaN3)后發(fā)現(xiàn)Ca2+的增加并沒有受到抑制，說明了在滲透條件下，Ca2+可能是NO在不定根發(fā)生過程中的下游信號分子[71]。此外，有研究證明CsCDPK1和CsCDPK5編碼的CDPK參與了CH4誘導NO積累促進不定根發(fā)生過程[72]。而且，在NO參與H2誘導黃瓜不定根發(fā)生過程中，H2和NO也可上調(diào)CsCDPK1和CsCDPK5基因表達[63]，調(diào)控不定根發(fā)生。這些研究說明，Ca2+提高抗氧化酶活性緩解逆境對植物不定根發(fā)生的抑制作用，同時提高內(nèi)源NO促進植物不定根發(fā)生。

4.2 NO與H2O2

H2O2作為一種活性氧，被認為是植物生理生化過程中的核心調(diào)控分子。在植物不定根的發(fā)生中也發(fā)揮著作用。Liao等[73]首次在萬壽菊中研究發(fā)現(xiàn)，NO和H2O2在植物不定根的發(fā)生中有共同的正向調(diào)控作用。張美玲等[74]在萬壽菊中發(fā)現(xiàn)了NO和H2O2共同協(xié)作對萬壽菊不定根的促進作用比NO或者H2O2單獨作用更加顯著，證明了NO和H2O2對萬壽菊不定根的發(fā)生具有協(xié)同作用。經(jīng)過NO和H2O2處理后的萬壽菊內(nèi)源Ca2+的含量是增加的，而且，Ca2+處理提高了內(nèi)源性NO和H2O2水平。Ca2+是通過提高內(nèi)源NO和H2O2的水平來促進萬壽菊不定根發(fā)生[16]。在IBA誘導的不定根發(fā)生中也發(fā)現(xiàn)有NO和H2O2的參與[75]。3-O-C10-HL(N-3-decyl-homoserine lactone，N-3-癸?；?高絲氨酸內(nèi)酯)是一種調(diào)節(jié)種群密度的細菌群體感應信號分子，在綠豆幼苗中通過H2O2和NO誘導環(huán)鳥苷單磷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)信號促進生長素誘導的不定根發(fā)生[76]。在一個涉及H2O2、NO、Ca2+、 cGMP和MAPK的信號網(wǎng)絡中H2O2和NO均作為信號網(wǎng)絡的重要組成部分來誘導不定根形成[77]。在生長素誘導不定根發(fā)生過程中，H2O2和NO參與兩條平行的下游信號通路，H2O2也是不定根發(fā)生過程中NO信號的下游分子[77](圖2)。

4.3 NO與其他分子

除了上述幾種物質(zhì)，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，CH4作為一種最簡單的有機物，在黃瓜外植體中可提高NOS活性促進NO積累，從而誘導黃瓜不定根的發(fā)生(圖2)，而且，添加cPTIO可顯著抑制黃瓜不定根的發(fā)生[73]，以此證明在CH4誘導的黃瓜不定根發(fā)生中是NO發(fā)揮作用。此外，在植物體內(nèi)生長素低于正常水平時，血紅素也能促進黃瓜外植體不定根發(fā)生[55]。而在黃瓜不定根發(fā)生中血紅素和NO在同一個信號途徑，由血紅素介導NO的產(chǎn)生是NOS-Like或者L-Arg途徑來完成的[78]。因此，NO可能在血紅素的下游促進不定根的形成。CsHO1是從黃瓜中分離出來的血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO-1)基因，生長素可以迅速誘導HO-1來影響不定根的發(fā)生，施加SNP后，NO導致CsHO1誘導的融合蛋白水平上調(diào)[77]，進而促進黃瓜不定根的發(fā)生。

H2作為一種自然界最小的氣體分子，它和NO協(xié)作促進黃瓜不定根的發(fā)生，Zhu等[62]研究發(fā)現(xiàn)，HRW對黃瓜不定根發(fā)生有促進作用，其中50% HRW對其促進效果最好，而內(nèi)源NO的產(chǎn)生與HRW誘導的不定根發(fā)生密切相關，當內(nèi)源NO產(chǎn)生被阻斷時，HRW在不定根中的促進作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)，NO可能作用于H2誘導不定根信號通路的下游。而且H2和NO還上調(diào)與細胞周期相關蛋白如CycA(Cyclin type A，A型細胞周期蛋白)、CycB(Cyclin type B，B型細胞周期蛋白)、CDKA(Cyclin dependent kinase A，周期蛋白依賴性激酶A)和CDKB(Cyclin dependent kinase B，周期蛋白依賴性激酶B)的表達來激活細胞周期。后來進行深入研究發(fā)現(xiàn)，HRW處理黃瓜外植體中上調(diào)的基因與NR有關，使得NR活性升高，NO產(chǎn)生增加，從而促進黃瓜不定根的發(fā)生(圖2)。與此同時，Zhu等[79]還發(fā)現(xiàn)，HRW能促進NO積累和提高NOS活性。在NOS和NR抑制劑存在的情況下，H2誘導的不定根發(fā)育發(fā)生逆轉(zhuǎn)，說明在抑制劑存在的條件下NOS仍然可能產(chǎn)生NO促進H2誘導的不定根發(fā)生(圖2)。

CDPK，鈣依賴蛋白激酶；CAT，過氧化氫酶；SOD，超氧化物歧化酶；APX，抗壞血酸過氧化物酶；NR，硝酸還原酶；NOS，NO合酶；GSNOR，S-亞硝基谷胱甘肽還原酶。 CDPK， Calcium dependent protein kinase; CAT， Catalase; SOD， Superoxide dismutase; APX， Ascorbic acid peroxidase; NR， Nitrate reductase; NOS， Nitric oxide synthase; GSNOR， S-nitroso glutathione reductase.圖2 NO與其他分子互作促進植物不定根的發(fā)生Fig.2 In teraction of NO with other molecules in promoting adventitious roots in plants

5 問題與展望

隨著研究的深入，NO在植物體中的產(chǎn)生及其在植物生長發(fā)育以及在環(huán)境響應方面的功能研究取得了一定的進展。NO在植物不定根發(fā)生的信號網(wǎng)絡中扮演著重要角色，這點是毋庸置疑的。而且NO和生長素、乙烯等激素以及其他信號分子物質(zhì)如H2、H2O2、Ca2+等共同在植物不定根發(fā)生的信號網(wǎng)絡中發(fā)揮作用也逐漸被人們證明。但是，是否有未知的物質(zhì)亦參與到NO誘導植物不定根發(fā)生中的信號網(wǎng)絡尚需進一步研究。此外，在實際生產(chǎn)中，NO是否可以應用于植物營養(yǎng)繁殖等生產(chǎn)實踐需進一步探索。

盡管已經(jīng)證實了NO在植物不定根中是一個關鍵的信號分子，但是，植物不定根的發(fā)生是一個復雜過程，受到營養(yǎng)狀況、相關的應激反應、生物相互作用和遺傳特性等多種內(nèi)、外源性因素的影響。而且，有關NO參與植物不定根發(fā)生的研究大多集中在生理水平上，而在分子水平上的研究相對較少。目前已有很多研究結(jié)果表明，NO和內(nèi)源物質(zhì)共同協(xié)作調(diào)控植物不定根的發(fā)生。但是，NO與內(nèi)源物質(zhì)是如何相互協(xié)作促進不定根發(fā)生的；NO在誘導不定根發(fā)生前必須在植物體內(nèi)感知、傳遞和表達，這一系列的信號轉(zhuǎn)導過程是如何進行的。這些問題的研究對解析植物不定根發(fā)生機理有很大的幫助。