8種易裂果實(shí)中果膠酶生物信息學(xué)分析

劉亞令，解瀟冬，耿雅萍，楊俊強(qiáng)，張鵬飛

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，山西 太原 030031)

裂果是一種多發(fā)生在果實(shí)膨大期的果樹常見病，主要表現(xiàn)為果實(shí)崩裂與開裂2種現(xiàn)象。櫻桃、西瓜、番茄、棗等多種水果常因裂果病的發(fā)生造成不同程度的減產(chǎn)而致使經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。比較常見的棗一般年份有30%裂果率，嚴(yán)重情況下能達(dá)到60%的裂果率甚至絕收[1]；櫻桃每年會(huì)有30%裂果率，嚴(yán)重時(shí)也會(huì)達(dá)到80%[2]；葡萄、甜橘等水果每年也會(huì)有50%的裂果產(chǎn)生，易裂番茄裂果率幾乎達(dá)到100%[3]。裂果病的發(fā)生因素是多方面的，目前有關(guān)于裂果病的研究主要集中在氣候、土壤、水分、礦質(zhì)等外界條件,果實(shí)結(jié)構(gòu)、遺傳因素、內(nèi)源激素、種質(zhì)資源等內(nèi)在因素2個(gè)方面展開[4～6]。在裂果病防御中，除了改善選種育種和農(nóng)耕等措施之外，噴施CaCl2是一種廣泛運(yùn)用于多種果樹裂果的有效防治方法[7～9]，主要是由于Ca2+與植物細(xì)胞壁的主要成分之一的果膠結(jié)合形成果膠鈣鹽，從而增加細(xì)胞壁的穩(wěn)定性以及維持細(xì)胞間作用力，以達(dá)到防止裂果的目的。

果膠酶(Pectinase)作為一種分解果膠的直接功能酶，其含量和活性直接影響到細(xì)胞壁的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響裂果的發(fā)生。郭紅彥等發(fā)現(xiàn)鈣處理壺瓶棗可以使果實(shí)中果膠及纖維素含量增加，細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶——果膠酶和纖維素酶活性減低[10]；李歡等在駿棗裂果研究中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于不裂果的駿棗，裂果駿棗中果膠酶和纖維素酶的相關(guān)基因表達(dá)明顯上調(diào)[11]；張川在裂果番茄細(xì)胞壁代謝研究中得出，隨著番茄果實(shí)的成熟，果膠纖維素等物質(zhì)的含量下降，同時(shí)果膠酶和纖維素酶等含量及活性增加[3]；除此之外，在蘋果、枇杷等多種水果中也發(fā)現(xiàn)果膠酶與裂果發(fā)生存在一定相關(guān)性[12,13]，這些結(jié)果為裂果機(jī)制的研究以及裂果病的防治奠定了一定的基礎(chǔ)。

果膠酶一般可以分為3類：果膠酯酶(Pectinesterase，PE)、多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)和果膠裂解酶(Pectatelyase，PL)，其中前2種在植物和微生物中都有存在，第三種僅存在于微生物中。本文主要利用生物信息學(xué)軟件和在線工具，對(duì)擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.)、番茄(LycopersiconesculentumMill.)、蘋果(MalusdomesticaL.)、白梨(PyrusbretschneideriRehd.)、葡萄(VitisviniferaL.)、棗(ZiziphusjujubaMill.)、甜櫻桃(Cerasusavium(L.)Moench.)、甜橙(Citrussinensis(L.)Osbeck)、桃(AmygdaluspersicaL.)的果膠酯酶和多聚半乳糖醛酸酶進(jìn)行分析。通過對(duì)2種酶的核酸和蛋白質(zhì)序列的比對(duì)和預(yù)測(cè)，了解其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及同源關(guān)系等特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究果膠酶生理調(diào)控機(jī)制、裂果發(fā)生機(jī)制及其分子水平上的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所選擇的材料為易裂果的植物，包括番茄、蘋果、白梨、葡萄、棗、甜櫻桃、甜橙、桃等，擬南芥作為序列比對(duì)的模式植物，生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)所用的DNA、mRNA以及蛋白質(zhì)序列材料均來源于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，其基因ID、mRNA及蛋白質(zhì)序列登錄號(hào)如表1所示。

表1 材料信息

1.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及親水性分析

利用在線工具ProtParam[14](http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析，利用ProtScale[15](https://web.expasy.org/protscale/)對(duì)蛋白質(zhì)親水性和疏水性進(jìn)行分析。

1.3 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位分析

利用德泰生物科技有限公司平臺(tái)上在線工具(http://www.detaibio.com/tools/ transmembrane.html)對(duì)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，利用PSORT Prediction[15](http:// psort1.hgc.jp /form.html)對(duì)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析。

1.4 蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)在NetOGlyc平臺(tái)進(jìn)行預(yù)測(cè)，其中O-糖基化位點(diǎn)在NetOGlyc 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)，N-糖基化位點(diǎn)在NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)進(jìn)行預(yù)測(cè)，磷酸化位點(diǎn)在NetPhos 3.1進(jìn)行預(yù)測(cè)(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)[14]。

1.5 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)利用PRABI-GERLAND在線平臺(tái)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行預(yù)測(cè)，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)利用RaptorX(http://raptorx.uchicago.edu/ StructPredV2/predict/)進(jìn)行預(yù)測(cè)[15]。

1.6 進(jìn)化樹的構(gòu)建及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析

先利用ClustalX對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，再利用軟件DNAman對(duì)所得結(jié)果作序列同源性比對(duì)圖；利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。利用MEME[16]在線平臺(tái)(http://meme-suite.org/tools/meme)對(duì)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及親水性分析

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)結(jié)果見表2。蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)在蛋白質(zhì)功能行使及應(yīng)用等方面有重要影響。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(Point Isoelectric，pI)是蛋白質(zhì)在溶液狀態(tài)下，溶液中正負(fù)離子所帶電荷達(dá)到“中和”時(shí)的溶液pH值，在蛋白質(zhì)分離提純中有重要作用。不穩(wěn)定系數(shù)是判斷蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的一種標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)不穩(wěn)定系數(shù)小于40，則蛋白質(zhì)穩(wěn)定，大于40則蛋白質(zhì)處于不穩(wěn)定狀態(tài)。以擬南芥為對(duì)照，分析8種易裂果水果的果膠酯酶和多聚半乳糖醛酸酶：在所有的果膠酯酶中，擬南芥果膠酯酶最小由352個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為39 057.97 Da，其他水果的果膠酯酶大小相差不大，氨基酸長(zhǎng)度范圍為536～571 aa，相對(duì)分子質(zhì)量大小為59 007.66～62 856.40 Da。其中番茄、甜橙和棗的果膠酯酶等電點(diǎn)比較低，蛋白所帶負(fù)電荷，其余均為正電荷。穩(wěn)定性方面，所有的果膠酯酶蛋白都比較穩(wěn)定。所有多聚半乳糖醛酸酶的大小相差不大，氨基酸序列長(zhǎng)度范圍為393～460 aa，相對(duì)分子質(zhì)量41 257.55～49 449.76 Da，其中番茄、葡萄、桃、棗的多聚半乳糖醛羧酶所帶負(fù)電荷，等電點(diǎn)較低，甜櫻桃為中性電荷，等電點(diǎn)為7.12，擬南芥、白梨、蘋果、甜橘、甜櫻桃則帶正電荷。穩(wěn)定性方面，蘋果多聚半乳糖醛酸酶表現(xiàn)較為不穩(wěn)定，其余物種的多聚半乳糖醛酸酶酶都相對(duì)穩(wěn)定(表2)。

表2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

蛋白質(zhì)的親水性和疏水性是組成其所有氨基酸親水性和疏水性的平均表現(xiàn)，氨基酸的親水性或疏水性是由所帶基團(tuán)決定的，根據(jù)相似相溶，極性基團(tuán)能夠與水親和，而非極性基團(tuán)親和力則比較小。通過對(duì)擬南芥和8種水果的果膠酯酶和多聚半乳糖醛酸酶的親水性和疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)(表3)：擬南芥(圖1a)和所有果膠脂酶都表現(xiàn)為親水性，番茄果膠脂酶親水性較小，僅為-0.086。在所有的多聚半乳糖醛酸酶中，擬南芥(圖1b)、蘋果、桃、甜橙、甜櫻桃的多聚半乳糖醛酸酶表現(xiàn)為疏水性，其余4種則表現(xiàn)為親水性。在所有的酶蛋白親水性和疏水性預(yù)測(cè)中，最強(qiáng)疏水性位置多在丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)等非極性氨基酸上和少數(shù)在中性天冬酰胺(Asn)上，最強(qiáng)親水性位置多在谷氨酰胺(Gln)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)等極性氨基酸和天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)等酸性氨基酸上。通過了解蛋白質(zhì)的親水性和疏水性，可以知道其作用環(huán)境，在亞細(xì)胞定位上也有一定程度的指示作用。

2.2 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位分析

蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及與質(zhì)膜結(jié)合行使功能時(shí)有重要作用。通過對(duì)所有酶蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位分析(表4)：除甜櫻桃果膠酯酶(圖2b)、甜橙多聚半乳糖醛酸酶(圖2c)、棗多聚半乳糖醛酸酶(圖2d)3種沒有跨膜結(jié)構(gòu)，其余的酶蛋白都與擬南芥果膠酯酶(圖2a)一樣，有大約20 aa大小的跨膜結(jié)構(gòu)。定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：大部分酶蛋白存在于細(xì)胞外，少部分分布在細(xì)胞質(zhì)膜上，而棗多聚半乳糖醛酸酶僅有37%的概率存在于細(xì)胞外，在不含有跨膜結(jié)構(gòu)的情況下，推測(cè)其還可能存在于細(xì)胞質(zhì)或液泡中。

表4 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位

Table 4 Protein transmembrane structure and subcellular localization

基因名稱GeneName跨膜結(jié)構(gòu)位置Transmembranestructurelocation亞細(xì)胞定位Subcellularlocalization概率ProbabilityAtPE13～35細(xì)胞外60.4%LePE20～42細(xì)胞質(zhì)膜79.0%PbPE21～43細(xì)胞質(zhì)膜79.0%MdPE7～29細(xì)胞外82.0%VvPE7～29細(xì)胞外82.0%ApPE7～29細(xì)胞外82.0%CsPE7～24細(xì)胞外82.0%CaPE-/-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜82.0%ZjPE7～29細(xì)胞外76.7%AtPG13～35細(xì)胞外81.0%LePG7～29細(xì)胞外82.0%PbPG7～29細(xì)胞外59.0%MdPG13～35細(xì)胞質(zhì)膜79.0%VvPG7～26細(xì)胞外62.8%ApPG7～29細(xì)胞外82.0%CsPG-/-細(xì)胞外76.2%CaPG7～29細(xì)胞外82.0%ZjPG-/-細(xì)胞外37.0%

2.3 O、N-糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

糖基化對(duì)蛋白質(zhì)包裝及轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及功能調(diào)節(jié)等多個(gè)方面都有影響，它是蛋白質(zhì)加工完成后對(duì)蛋白質(zhì)的修飾作用，根據(jù)所連接的糖苷鏈的不同，可以分為N-糖基化和O-糖基化，前者開始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，最終完成在高爾基體，后者整個(gè)過程都是在高爾基體中完成。磷酸化是另一種蛋白質(zhì)修飾進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能和活力的方式，磷酸化位點(diǎn)主要在氨基酸序列的絲氨酸(S)、酪氨酸(Y)、蘇氨酸(T)殘基上。由表5和圖3可以看出，在果膠酯酶中，擬南芥糖基化位點(diǎn)(4個(gè))和磷酸化位點(diǎn)(50個(gè))最少，甜橙糖基化位點(diǎn)(22個(gè))和磷酸化位點(diǎn)(72)最多；就多聚半乳糖醛酸酶而言，蘋果、葡萄、桃的糖基化位點(diǎn)均為2個(gè)，其中蘋果無O-糖基化位點(diǎn)，葡萄無N-糖基化位點(diǎn)，棗的糖基化位點(diǎn)最多為17個(gè)，且磷酸化位點(diǎn)(58)也是最多，磷酸化位點(diǎn)最少的是甜橙，僅為39個(gè)，而且甜橙沒有O-糖基化位點(diǎn)。

2.4 蛋白質(zhì)二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是其氨基酸序列的主鏈在氫鍵作用力下，進(jìn)行螺旋、折疊等一些簡(jiǎn)單的空間排列。通過預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)(表6)：在果膠酯酶中，擬南芥的α-螺旋僅為15.34%，其余物種的α-螺旋則在30.41%～36.80%，β-轉(zhuǎn)角處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的區(qū)間，在4.26%～7.04%，無規(guī)卷曲在序列中所占比例最大，占比為36.97%～48.86%，擬南芥擴(kuò)展鏈(側(cè)鏈)最大為31.54%，其余擴(kuò)展鏈占比大約為20%；在多聚半乳糖醛酸酶中，無規(guī)卷曲在氨基酸序列占到近一半的比例，擴(kuò)展鏈占32.22%～40.97%，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角所占比例相對(duì)較小。

蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)是在二級(jí)或超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，在疏水相互作用、氫鍵、范德華力和靜電作用等作用力的加持下，進(jìn)一步盤曲折疊形成的穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。通過對(duì)所有酶蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)：果膠酯酶是由小的β-折疊片層通過無規(guī)卷曲鏈接在一起，在經(jīng)過α-螺旋形成的三維結(jié)構(gòu)，中間或旁邊還鏈接有一些小的α-螺旋結(jié)構(gòu)，除了擬南芥之外的其他物種的三級(jí)結(jié)構(gòu)中還有由3或4個(gè)長(zhǎng)的α-螺旋結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)角連接在一起的結(jié)構(gòu)，2個(gè)部分共同組成果膠脂酶(圖4)。多聚半乳糖醛酸酶和果膠酯酶結(jié)構(gòu)上有些類似，都是由小的β-折疊片層鏈接在一起，再經(jīng)過α-螺旋形成三維結(jié)構(gòu)，但是多聚半乳糖醛酸酶的小α-螺旋片段連接在側(cè)鏈或者序列末端，而不是夾在其間，或者獨(dú)立成結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖2 跨膜結(jié)構(gòu)分析

表5 蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)

2.5 進(jìn)化樹的構(gòu)建及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析

進(jìn)化樹和序列比對(duì)均能揭示物種或基因之間的同源性及親緣關(guān)系，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖6)及序列比對(duì)(圖7)得出：果膠脂酶中，擬南芥為獨(dú)立一支，8種水果為一大支，其中棗與甜櫻桃、番茄與白梨、葡萄與桃和蘋果各自成小支，序列比對(duì)同源性為58.23%，結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域分析(圖8a)得出結(jié)構(gòu)上分類與進(jìn)化樹結(jié)果一致，擬南芥只有4個(gè)motif，其余物種則有11～13個(gè)motif，其中motif 1、motif 2、motif 3、motif 4為所有物種所具有，并且motif 1中TFNG序列、motif 2中AVARCYQDGDFig.序列、motif 3中LGRPWYRVPGWWTYEG序列、motif 4中FW序列高度保守，與序列比對(duì)結(jié)果相一致；在多聚半乳糖醛酸酶的分析中，棗為獨(dú)立一支，其余物種為一支，甜櫻桃與桃和蘋果、葡萄與白梨、番茄與擬南芥各自為支，通過序列比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域分析(圖8b)，發(fā)現(xiàn)它們的同源性為57.33%，且除了棗中僅有4個(gè)motif外，其余8個(gè)物種含有10～12個(gè)motif，motif 1、motif 5為共有的motif。

圖3 擬南芥果膠酶蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)

表6 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

3 討論與結(jié)論

果膠酶作為果實(shí)裂果過程中一種關(guān)鍵酶，其功能主要是分解細(xì)胞壁中的果膠，破壞或降低細(xì)胞壁的延展性，從而增加了裂果的發(fā)生。在前人研究中發(fā)現(xiàn)，Ca2+可以有效的降低果膠酶的活性，如通過Ca2+處理的番茄，易裂果和耐裂果番茄中的果膠酶活性分別降低57.06%和30.21%，總果膠(原果膠和可溶性果膠)含量分別增加93.20%和60.19%[3]；同樣用Ca2+處理不同時(shí)期的壺瓶棗，發(fā)現(xiàn)果皮和果肉中的果膠酶活性分別下降84.5%～89.9%和76.2%～78.9%，原果膠含量分別增加110.4%～160.7%和212.3%～304.3%[10]。目前在蘋果、番茄、棗等多種水果的研究中初步窺探到果膠酶是一種裂果病變表達(dá)上調(diào)的酶，為了進(jìn)一步了解其作用機(jī)制，在分子水平上進(jìn)行分析顯得尤為重要。

本文以擬南芥為對(duì)照，分析對(duì)比了8種易裂果水果的果膠脂酶和多聚半乳糖醛酸酶,結(jié)果表明：果膠脂酶大小在352～571 aa，且大部分果膠酯酶蛋白都有一個(gè)22 aa的跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位多存在與細(xì)胞質(zhì)膜或者細(xì)胞外，是一種親水性蛋白，且多種蛋白質(zhì)修飾來豐富和穩(wěn)定其功能。而多聚半乳糖醛酸酶亞細(xì)胞定位多存在于細(xì)胞外，大小為393～460 aa不等，親水性和疏水性在不同的物種中存在差異。這些結(jié)果與馬婧[17]在楊樹果膠酯酶基因家族的研究中的結(jié)果相一致，并且它們具有一樣的motif基序。本文較全面的分析了這2種酶的理化性質(zhì)，為進(jìn)一步從基因或蛋白等分子水平上研究裂果病變機(jī)理、裂果病變防御提供了理論基礎(chǔ)。

本文通過分析得出，果膠酶在不同物種中同源性較高，進(jìn)化比較保守，所以推測(cè)裂果病在不同物種中的作用機(jī)制可能存在一定程度的相似性，雖然噴施Ca2+在不同易裂果水果中都有一定的防治效果，但并不能從根本上防止裂果的發(fā)生，效果并不是特別理想。Dautt-Castro等在芒果、葡萄、柑橘等水果中對(duì)果膠酶在分子水平進(jìn)行了一些研究[18～20]，能夠初步了解果膠酶在果實(shí)成熟過程中作用機(jī)制，結(jié)合運(yùn)用生物信息學(xué)分析及基因編輯等新技術(shù)，尋找降低果實(shí)成熟過程中果膠酶表達(dá)水平的途徑，有望有效地從根本上降低或防止裂果的發(fā)生，同時(shí)也為分子水平培育新品種提供新的啟示。

圖4 不同物種果膠酯酶三級(jí)結(jié)構(gòu)

圖5 不同物種多聚半乳糖醛酸酶三級(jí)結(jié)構(gòu)

圖6 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖7 序列比對(duì)分析

圖8 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)