新孢子蟲病—分子流行病學(xué)及發(fā)病機(jī)制綜述

Asis Khn * , Jhngheer S. Shik , Ptrici Sikorski , Jitender P. Duey , Michel E. Grigg

a Molecular Parasitology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health,Bethesda, MD 20892, USA

b Animal Parasitic Disease Laboratory, Beltsville Agricultural Research Center, Agricultural Research Service, US Department of Agriculture, Beltsville, MD 20705, USA

1. 歷史回顧

犬新孢子蟲（N. caninum）是一種球蟲原蟲，屬于頂復(fù)門[1]，1988年以前人們常將其與密切相關(guān)的頂復(fù)門寄生蟲弓形蟲（T.gondii）混淆[2,3]。1984年，Bjerk?s等[4]首次描述了挪威的一窩6只拳師犬幼犬先天性感染的腦脊髓炎（腦和脊髓疾?。┖图⊙祝∪饧膊。┎±?，這是由某一不明寄生蟲導(dǎo)致的。這種寄生蟲于1988年被正式確認(rèn)為犬新孢子蟲，其依據(jù)是對美國波士頓安格爾紀(jì)念動物醫(yī)院（Angell Memorial Animal Hospital）對1952—1987年死于弓形蟲樣疾病的狗和貓的數(shù)千個組織切片進(jìn)行回顧性分析，該組織切片對抗弓形蟲抗體的免疫組織化學(xué)反應(yīng)呈陰性[2,3]。

2. 生活史

犬新孢子蟲寄主范圍很廣，且擁有一個由兩種不同的繁殖方式組成的多宿主的生活史：①無性繁殖，發(fā)生在中間寄主中；②有性繁殖，僅發(fā)生在終末宿主犬中，包括狗[5]、郊狼[6]、灰狼[7]和野狗[8]（圖1）。雖然弓形蟲的有性繁殖階段已經(jīng)十分明確，但犬新孢子蟲的有性繁殖階段尚不清楚，如裂體增殖和配子生殖。犬新孢子蟲唯一已知的性階段是非孢子化二倍體卵囊，它對冷凍和干燥具有環(huán)境抵抗力。未孢子化的卵囊從受感染的犬的糞便中脫落，并在環(huán)境中進(jìn)行減數(shù)分裂，形成單倍體子孢子（圖1）[3]。在中間宿主攝入孢子化卵囊之后，孢子體從卵囊中釋放出來，并轉(zhuǎn)化為一個迅速生長的階段（稱為速殖子），從而傳播感染（圖1）。在納蟲空泡（parasitophorous vacuole, PV）內(nèi)，速殖子侵入宿主細(xì)胞，通過重復(fù)的內(nèi)生性復(fù)制無性繁殖。經(jīng)過幾輪的胞內(nèi)增殖后，寄生蟲溢出宿主細(xì)胞[9]重新感染新的宿主細(xì)胞，隨后產(chǎn)生宿主特異性的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。由于宿主的免疫反應(yīng)和其他環(huán)境因素，速殖子轉(zhuǎn)化為一個緩慢生長的半休眠階段（稱為緩殖子），并存在于組織包囊中（圖1）。組織包囊可以在宿主細(xì)胞中長期存在，并且可以轉(zhuǎn)化為速殖子以產(chǎn)生慢性感染，特別是針對免疫功能低下的宿主[10]。

圖1. 多宿主的新孢子蟲生活史。轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)[3]。

3. 傳染

盡管具有廣泛的宿主范圍和復(fù)雜的生活史，但新孢子蟲分別感染牛和狗作為其主要中間宿主和終宿主 [11]。牛可以通過攝入由終宿主排出的感染性卵囊橫向傳染，也可以經(jīng)胎盤或先天性傳播從一個受感染的懷孕母親向它的胎兒垂直傳播（圖1）。垂直傳播被認(rèn)為是新孢子蟲在牛群中最主要和最有效（80%）的傳播途徑。垂直傳播既可以通過妊娠母牛的卵囊源性感染進(jìn)行外源性傳播，也可以通過妊娠期間重新激活的慢性感染進(jìn)行內(nèi)源性經(jīng)胎盤傳播[3]。感染新孢子蟲的胎兒可以在任何胎齡內(nèi)流產(chǎn)，被吸收，木乃伊化，自體溶解，或出生后持續(xù)感染。其他中間宿主包括綿羊、山羊、鹿和狗也有過經(jīng)胎盤傳播的記錄。通過精液和牛奶傳播被認(rèn)為是不可能的[3]。狗通常通過攝入受感染的中間宿主組織而造成經(jīng)口感染。貓是弓形蟲和哈蒙球蟲（Hammondia hammondi）的終末宿主[12]，與貓不同的是，狗在性傳播過程中通常會產(chǎn)生較少的新孢子蟲卵囊?？紤]到狗和牛在獸群中的密切聯(lián)系[1,5]以及通過幾代牛進(jìn)行垂直傳播的可能性[13,14]，傳染的可能性明顯更高，因為寄生蟲可以在同一獸群內(nèi)的終末宿主和中間宿主之間長期維持和繁殖。這種通過無性繁殖和有性生殖在牛和狗之間的局部傳播周期可能正在塑造新孢子蟲的種群結(jié)構(gòu)。

4. 休斯新孢子蟲

鑒定新的新孢子蟲種（即休斯新孢子蟲）的首次報道是在1998年，宿主是美國加利福尼亞州的一匹患有馬原蟲性腦脊髓炎的馬。休斯新孢子蟲被認(rèn)為是一個分離出來的物種，因為它似乎僅限于馬[15]，且與犬新孢子蟲相比，有明顯的抗原和序列差異。例如，表面抗原SAG1在NcSAG1與NhSAG1之間的氨基酸同源性差異為6% [16]。因此，NcSAG1衍生的mAb 6C11不與休斯新孢子蟲SAG1雜交[16]。相似地，另一種表面抗原SRS2（NcSRS2和NhSRS2）表現(xiàn)出9%的氨基酸差異。因此，這兩種表達(dá)豐富的表面抗原之間的抗原特異性已被用來產(chǎn)生有效的分子標(biāo)記物，以區(qū)分犬新孢子蟲和休斯新孢子蟲[16]。休斯新孢子蟲和犬新孢子蟲之間的致密顆粒蛋白GRA6和GRA7的比較分析也揭示了氨基酸序列和結(jié)構(gòu)組織的顯著差異[18]。除了這些抗原標(biāo)記物外，還使用了基于重復(fù)的ITS1區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列差異的敏感分子檢測方法來區(qū)分休斯新孢子蟲和犬新孢子蟲（7～9 bp）[19]。

有趣的是，在實驗性嚙齒動物感染過程中，犬新孢子蟲和休斯新孢子蟲之間這些基因差異也會導(dǎo)致表型差異。休斯新孢子蟲主要引起心肌組織壞死，而犬新孢子蟲病變主要見于肝臟、肺和大腦。此外，在沙鼠（Meriones unguiculatus）模型中，犬新孢子蟲和休斯新孢子蟲的致命性有顯著差異。沙鼠極易受犬新孢子蟲的經(jīng)口感染，導(dǎo)致大多數(shù)沙鼠在感染后6～13 d內(nèi)死亡[20]。相反，休斯新孢子蟲感染在沙鼠中不會產(chǎn)生明顯的臨床癥狀，而只存在一些微小的病變。然而，這兩個物種之間的遺傳和生物學(xué)差異是否是由于物種特異性差異或蟲株特異性差異（如弓形蟲）引起的還需要進(jìn)一步闡明。由于種間雜交最近已被證明發(fā)生在利什曼原蟲領(lǐng)域，犬新孢子蟲和休斯新孢子蟲之間的實驗性遺傳雜交也許可以揭示這兩種寄生蟲是否應(yīng)該被認(rèn)為是單獨的物種[21]。綜上所述，目前的共識是：新孢子蟲種群結(jié)構(gòu)至少由兩個獨立的新孢子蟲種類組成，即犬新孢子蟲和休斯新孢子蟲，它們由一個共同的祖先進(jìn)化而來，并且已經(jīng)獨立地擴(kuò)展以適應(yīng)它們的各種脊椎動物宿主。

5. 檢測

5.1. 形態(tài)學(xué)檢測

目前已經(jīng)開發(fā)了幾種形態(tài)學(xué)檢測方法來識別感染樣本中的新孢子蟲病。細(xì)胞學(xué)通過顯微鏡檢查細(xì)胞自旋涂片或印模涂片，其次是Diff-Quick快速染色，Giemsa染色和（或）蘇木精或伊紅（hematoxylin or eosin, HE）染色病變，是領(lǐng)域內(nèi)快速檢測新孢子蟲病最常規(guī)的方法。然而，由于與密切相關(guān)的寄生蟲在形態(tài)上的相似性，除了Neospora的標(biāo)志之一厚壁（高達(dá)4 μm）組織包囊的存在外，很難將新孢子蟲與弓形蟲和哈蒙球蟲區(qū)分開來。透射電子顯微鏡也被用來將新孢子蟲與弓形蟲和肉孢子蟲進(jìn)行區(qū)分，其基礎(chǔ)是新孢子蟲中存在電子密集的棒狀體。相反，弓形蟲具有低電子密度，而在肉孢子蟲裂殖子中沒有棒狀體。免疫組織化學(xué)（immunohistochemical, IHC）染色是另一種檢測固定組織中的新孢子蟲病的方法，它敏感性強(qiáng)且被廣泛使用 [22-24]。親和素-生物素復(fù)合物間接免疫過氧化物酶和過氧化物酶-抗過氧化物酶技術(shù)也是具有相同敏感性的方法。針對新孢子蟲的單克隆抗體和多克隆抗體均被用于IHC，其中兔多克隆抗體比單克隆抗體具有更高的敏感性。然而，最近，NcSRS2和NcGRA7單克隆抗體[24]的組合被證明比多克隆抗體更特異、更敏感，從而抑制了多克隆抗體與弓形蟲或相關(guān)球蟲寄生蟲交叉反應(yīng)的可能性。

5.2. 血清學(xué)檢測

自從發(fā)現(xiàn)新孢子蟲病以來，已經(jīng)開發(fā)了幾種血清學(xué)方法來檢測它。感染后，可在兩周內(nèi)檢測到新孢子蟲特異性免疫球蛋白M（immunoglobulin M, IgM）抗體，而IgG抗體需要幾周時間才能達(dá)到檢測水平，滴度在初次感染后6個月達(dá)到峰值。幾種抗原已被廣泛用于檢測，包括表面抗原NcSRS2、NcSAG1、NcSAG4和Ncp40，細(xì)胞骨架蛋白NCPF，致密顆粒蛋白NcGRA2、NcGRA6和NcGRA7，絲氨酸蛋白酶NcSUB1以及微線體蛋白NcMIC6和NcMIC10 [25]。間接熒光抗體試驗（indirect fluorescent antibody test, IFAT）是應(yīng)用于新孢子蟲檢測的第一種基于抗體的方法[2]。在這種方法中，完整的速殖子被固定在蓋玻片上，并與試驗血清一起孵育；然后它們與熒光素標(biāo)記的針對宿主免疫球蛋白的二抗進(jìn)行雜交。IFAT被認(rèn)為是檢測新孢子蟲病的參考試驗，因為該試驗與密切相關(guān)的頂復(fù)門寄生蟲的交叉反應(yīng)性很小，可以通過滴度血清來量化[26,27]。通過使用新孢子蟲特異性抗原[28,29]取代改良凝集試驗（modified agglutination test, MAT）中的弓形蟲抗原，一種直接的新孢子蟲凝集試驗（Neosporaagglutination test, NAT）也得到了發(fā)展。NAT已被用來測試在多達(dá)16種不同動物物種的大量血清中是否存在IgM，并被發(fā)現(xiàn)與IFAT一樣敏感。然而，最廣泛和最商業(yè)化的血清學(xué)檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）[30]，它可對大量樣品進(jìn)行自動化掃描，具有較高的特異性。已經(jīng)建立了各種ELISA方法，如間接ELISA法（iELISA）和細(xì)胞ELISA法（cELISA），主要采用速殖子總裂解或純化的天然抗原進(jìn)行聚苯板敏化作用[31,32]。利用天然或總抗原的一個缺點是可能與其他密切相關(guān)的球蟲寄生蟲發(fā)生交叉反應(yīng)[33]。因此，廣泛的新孢子蟲特異性抗原目前被用于包被ELISA板，以建立特異性[30,34,35]。同時利用IgG、IgA和IgE抗體建立了基于ELISA的親和性試驗，以估計感染的時機(jī)。其他血清學(xué)技術(shù)，如基于NcGRA6 [36]、NcSAG1 [37]的乳膠凝集試驗（latex agglutination test, LAT）和免疫印跡實驗（immunoblot,IB）[38]已經(jīng)被開發(fā)出來，但沒有得到廣泛的應(yīng)用。

6. 感染率

牛、肉牛、狗、山羊和其他家畜血清中新孢子蟲抗體的存在已在世界各地報道過，主要使用上述血清學(xué)方法。牛、狗、山羊和綿羊的血清感染率如圖2所示[3]。然而，值得一提的是，由于使用血清學(xué)方法的不同、臨界值的差異以及缺乏從受感染動物中分離活寄生蟲的驗證，不同研究小組的血清感染率數(shù)據(jù)是不可比較的[1]。盡管如此，在其他研究中已經(jīng)成功地從確定的宿主中分離出了可存活的寄生蟲，特別是狗，以及廣泛的中間宿主，如牛、羊、白尾鹿和水牛[1,3]。雖然實驗表明新孢子蟲在養(yǎng)牛業(yè)中只在牛和狗之間傳播，但上述任何中間宿主都可能作為新孢子蟲傳播的額外重要宿主而存在。例如，白尾鹿是美國新孢子蟲的主要宿主之一，其血清陽性率為88% [39]。人畜共患病傳播的可能性也是未知的。有人認(rèn)為，與弓形蟲不同，新孢子蟲和哈蒙球蟲對人類沒有傳染性。巴西、丹麥、埃及、韓國和美國的人體內(nèi)都檢測到了低滴度的新孢子蟲抗體[40-42]。雖然這一觀察結(jié)果可以用弓形蟲和新孢子蟲的抗原相似性來解釋，但在靈長類動物（Macaca mulatta）模型中已經(jīng)通過實驗描述了經(jīng)過胎盤傳播的新孢子蟲病[43,44]，新孢子蟲可以在不同的人類細(xì)胞系中進(jìn)行體外培養(yǎng)[45]。因此，這些數(shù)據(jù)提供了有關(guān)人畜共患疾病傳播可能性的線索。然而，尚未從人身上回收到活的寄生蟲或寄生蟲的DNA。

圖2. 牛、狗、山羊和綿羊等（x軸）不同宿主的新孢子蟲的總體血清陽性率的熱圖。y軸代表國家/地區(qū)。

7. 分子流行病學(xué)

新孢子蟲領(lǐng)域成功的分子流行病學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究需要從其廣泛的宿主和地理范圍中分離出大量蟲株以及合適的遺傳工具。與弓形蟲不同，新孢子蟲研究缺乏足夠的工具和分離蟲株以區(qū)分不同的新孢子蟲蟲株及其宿主限制機(jī)制。迄今為止，新孢子蟲蟲株的鑒定依賴于一些測序標(biāo)記，這些標(biāo)記已用于將新孢子蟲與密切相關(guān)的球蟲區(qū)分開來。但是，這些標(biāo)記不能區(qū)分不同的新孢子蟲蟲株。新孢子蟲中使用最廣泛的分子標(biāo)記是ssuRNA和pNc5（GenBank登錄號：X84238）中的18S rRNA和ITS1區(qū)域[43,44]，因為它們具有重復(fù)的特性，單拷貝基因?qū)酆厦告湻磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）檢測的敏感性低于多拷貝基因。在弓形蟲、哈蒙球蟲和新孢子蟲之間的18S rRNA基因中，僅檢測到少量的單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism,SNP），說明它們之間存在密切的關(guān)系。然而，利用通用引物、物種特異性化學(xué)發(fā)光DNA雜交探針[46]、使用新孢子蟲特異性引物進(jìn)行的第二輪巢式PCR [47]或PCR限制性片段長度多態(tài)性（PCR-restricted fragment length polymorphism, PCR-RFLP）與BsaJI酶[48]，這些SNP足以將新孢子蟲與弓形蟲和哈蒙球蟲區(qū)分開來。盡管可以利用18S rRNA區(qū)分親緣關(guān)系較近的寄生蟲，但目前尚未發(fā)現(xiàn)NC1、N.caninumLiverpool (Nc-Liv)、NC3、NCSweB1等不同新孢子蟲分離株之間的序列差異[43,44]。另一個ssuRNA標(biāo)記ITS1由于其高靈敏度和特異性也被廣泛用于物種特異性區(qū)分。隨后，為了提高檢測新孢子蟲1～10 fg基因組DNA的敏感性，設(shè)計了一種基于ITS1的單管嵌套式PCR [49]。該方法具有較高的靈敏度和特異性。但是，與18S rRNA位點不同，在NC-Bahia蟲株（南美起源）和新孢子蟲的不同犬和牛分離株之間發(fā)現(xiàn)了差異，包括NC1、Nc-Liv、BPA1、NC-SweB1和NcNZ1，它們在ITS1上共享相同的序列[15,44,50,51]。盡管后一種標(biāo)記對于檢測新孢子蟲極為敏感，但由于在循環(huán)新孢子蟲分離物中發(fā)現(xiàn)了高度的遺傳相似性，因此可能不適用于表征種內(nèi)蟲株異質(zhì)性或系統(tǒng)發(fā)育分析。另一個多拷貝基因pNc5已被廣泛用于檢測廣泛的中間宿主和最終宿主中的新孢子蟲感染。然而，由于這些引物被報道可以擴(kuò)增嚙齒類動物特異性DNA，因此它的特異性并不強(qiáng)[52]。最近，基于單基因測序的標(biāo)記包括14-3-3、表面抗原（SAG1、SAG4和SRS2）、分泌的致密顆粒蛋白（GRA6和GRA7）以及一些管家基因，如α-微管蛋白、β-微管蛋白和熱休克蛋白70（heat shock protein 70, HSP-70）被開發(fā)用于對來自某一特定地理區(qū)域的一些牛和犬新孢子蟲分離株進(jìn)行基因分型[16-18,53,54]。這些標(biāo)記在不同的新孢子蟲分離株中高度保守，這使它們在鑒別新孢子蟲分離株中的有效性受到質(zhì)疑。

與單拷貝基因序列標(biāo)記不同，小衛(wèi)星或微衛(wèi)星標(biāo)記被分類為可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列（variable number of tandem repeat, VNTR）DNA，在該物種的不同分離株之間捕獲了廣泛的遺傳多樣性。因此，小衛(wèi)星和微衛(wèi)星標(biāo)記已被廣泛用于密切相關(guān)的新孢子蟲分離株的分子區(qū)分 [55,56]。一項使用微衛(wèi)星標(biāo)記的基因分型研究確定了9種新孢子蟲之間的遺傳多樣性，而每種病原菌的DNA譜與其地理起源之間沒有關(guān)聯(lián)[55]。在另一項最新研究中，使用9種多位點微衛(wèi)星標(biāo)記對來自世界各地的11株新孢子蟲參考蟲株和來自西班牙、阿根廷、蘇格蘭和德國的96株新孢子蟲臨床蟲株進(jìn)行了基因分型[57]。微衛(wèi)星表征揭示了廣泛的遺傳多樣性，其中包括96個微衛(wèi)星多位點基因型。微衛(wèi)星標(biāo)記不能捕獲整個基因組的真實多態(tài)性，并且可能由于相似性而將蟲株誤分類為變異體[58]。然而，基于F統(tǒng)計值（F-statistics value,FST）和eBURST分析，使用這些標(biāo)記物可以識別出清晰的地理亞結(jié)構(gòu)，這可能表明隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，出現(xiàn)了新孢子蟲分離株[57]。因此，需要進(jìn)行系統(tǒng)分析，將相對非多態(tài)性的單基因位點與使用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定的遺傳多樣性進(jìn)行比較，以確定種群遺傳多樣性的真實程度。最近，宏基因組新一代測序（next-generation sequencing, NGS）已發(fā)展成為研究弓形蟲性腦炎的診斷工具[59]。因此，可以開發(fā)宏基因組新一代測序，以與新孢子蟲病病例有因果關(guān)系的靶標(biāo)獨立方式鑒定和基因分型。

8. 基因組

盡管弓形蟲、哈蒙球蟲和新孢子蟲在宿主范圍和其他生物學(xué)方面（如小鼠模型中的毒力）存在顯著差異，但基于全基因組測序，它們的基因組具有高度同義性[表1、圖3（a）] [60-62]。Nc-Liv是第一個使用Sanger測序技術(shù)測序到8倍覆蓋率的新孢子蟲基因組。它聚集成一個由585個超級重疊群和7121個基因組成的61 Mb基因組（歐洲核苷酸檔案庫，項目：CADU00000000；www.toxodb.org）。隨后，由于它們的高同位基因組，使用弓形蟲Me49基因組將這些超級重疊群重新組裝成14條染色體[圖3（a）] [60,61]。盡管大約在2800萬年前新孢子蟲和弓形蟲從它們的共同祖先中被分離出來，但根據(jù)惡性瘧原蟲和賴氏瘧原蟲之間的突變率計算得出的結(jié)果[63]，在這兩種瘧原蟲之間只觀察到少量的染色體重排和較低的遺傳信息凈增益/損失物種。一個例外是新孢子蟲（227NcSRS基因和52NcSRS假基因）中的表面抗原家族[尤其是SAG1相關(guān)序列（SAG1-related sequence, SRS）]的顯著擴(kuò)展，它們串聯(lián)排列在整個基因組的多基因簇中[圖3（b）]。在這些SRS中，新孢子蟲在速殖子階段僅表達(dá)25個NcSRS基因的一個子集，每個多基因簇僅表達(dá)一個基因?；贜c-Liv的速殖子以及基于鏈特異性RNA測序和鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)，已校正了超過1/3先前注釋的基因模型和未翻譯區(qū)（untranslated region, UTR）的最新預(yù)測遺傳結(jié)構(gòu)[64]。RNAseq數(shù)據(jù)的使用不僅顯著提高了新孢子蟲基因組的注釋質(zhì)量，而且還導(dǎo)致了對順式-天然反義轉(zhuǎn)錄本（cis-natural antisense transcript, cis-NAT）和長基因間非編碼RNA（long intergenic non-coding RNA, lincRNA）的鑒定[64]。有趣的是，對弓形蟲、哈蒙球蟲和新孢子蟲之間代謝途徑的比較分析發(fā)現(xiàn)，除了少數(shù)差異表達(dá)的基因和犬新孢子蟲中氮代謝基因的上調(diào)外，新陳代謝基因沒有重大變化 [61]。

表1 三種緊密相關(guān)的頂復(fù)門寄生蟲的比較分析

圖3. 緊密相關(guān)的頂復(fù)門寄生蟲新孢子蟲、弓形蟲和哈蒙球蟲的比較分析。（a）Circos圖表明三個緊密相關(guān)的頂復(fù)門寄生蟲之間的高度同基因組的基因組。外圈代表每個寄生蟲的帶注釋的染色體。使用NCBI blast V. 2.5在這些蟲株的參考序列（www.toxodb.org）中進(jìn)行核苷酸比對。允許同一性為70%或更高，e值小于0.001，最小片段大小為500 bp。使用Circos V. 0.69中的功能區(qū)鏈接，繪制了由核苷酸母帶發(fā)現(xiàn)的參考序列之間的同構(gòu)關(guān)系。（b）新孢子蟲（Nc）和哈蒙球蟲（Hh）中的弓形蟲Me49（Tg）的前10個Pfam結(jié)構(gòu)域的相對豐度表明，新孢子蟲中SAG/SRS結(jié)構(gòu)域的顯著擴(kuò)展。

9. 分子遺傳學(xué)工具

全基因組測序和轉(zhuǎn)錄分析的出現(xiàn)促進(jìn)了分子遺傳學(xué)工具的發(fā)展，以闡明新孢子蟲基因調(diào)控和發(fā)病機(jī)制的潛在機(jī)制。然而，為了闡明已經(jīng)通過基因組學(xué)研究鑒定的基因的功能，有必要開發(fā)操縱基因組的遺傳工具。由于與弓形蟲基因組高度同源[60,61]，現(xiàn)有的用于弓形蟲遺傳修飾的異源表達(dá)系統(tǒng)已初步用于新孢子蟲的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化[65]。利用弓形蟲GRA1啟動子，大腸桿菌lacZ基因也在新孢子蟲中穩(wěn)定表達(dá)[66]，這一轉(zhuǎn)基因株成為篩選抗寄生蟲分子的重要工具。隨后，弓形蟲的幾個基因，包括SAG1、GRA2、NTPase3和ROP2，也被成功轉(zhuǎn)染到新孢子蟲中，以更好地了解這些基因的分子機(jī)制。這項工作最終使ROP8基因得到鑒定。因此，弓形蟲基因在免疫學(xué)上不同的新孢子蟲背景中的異源表達(dá)[67]證明了研究重要的弓形蟲基因?qū)钜呙绾蜻x物開發(fā)的有用性[68]。繼成功的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染系統(tǒng)后，突變的二氫葉酸還原酶-胸苷酸合酶（dihydrofolate reductase-thymidylate synthase, DHFR-TS）對乙胺嘧啶有抗性[69]，并插入了穩(wěn)定的藥物選擇標(biāo)記，如氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶[70]，來研究新孢子蟲中的基因組編輯。最近，剛地弓形蟲的簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR）相關(guān)基因9（CRISPR/Cas9）系統(tǒng)已被有效地和專門地用于新孢子蟲的基因組編輯[71]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，已成功地從Nc-1表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的蟲株和Nc-Spain7分離物的NcGRA7基因中刪除GFP，并用乙胺嘧啶選擇標(biāo)記取代[71]。因此，CRISRP/Cas9系統(tǒng)將提供有效和可靠的方法，對新孢子蟲的基因組進(jìn)行精確的、有針對性的改變，以研究特定的基因功能[72]，檢測與新孢子蟲發(fā)病機(jī)制有關(guān)的基因或產(chǎn)生能夠?qū)毙院吐孕骆咦酉x病提供免疫保護(hù)的減毒活疫苗株。

10. 病原與宿主的相互作用

在進(jìn)化的過程中，宿主發(fā)展出復(fù)雜的免疫防御系統(tǒng)來對抗病原體，然而病原體已經(jīng)進(jìn)化出逃避宿主監(jiān)測并成功感染的策略。新孢子蟲感染大量的中間宿主。因此，能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞并逃避宿主免疫力對其生存和持續(xù)感染至關(guān)重要。為了進(jìn)入宿主細(xì)胞，新孢子蟲首先在速殖子和宿主細(xì)胞表面之間形成低親和力接觸，然后黏附到宿主細(xì)胞上。宿主細(xì)胞表面蛋白聚糖，特別是速殖子的硫酸軟骨素糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG）和緩殖子的末端唾液酸殘基，充當(dāng)促進(jìn)新孢子蟲感染的黏附受體[73,74]。新孢子蟲表面抗原，包括NcSAG1和NcSRS2，是促進(jìn)宿主與寄生蟲之間初始接觸的寄生蟲因子。有趣的是，全基因組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與親緣關(guān)系較近的弓形蟲（135個SRS基因）相比，新孢子蟲[223 個SRS基因，圖3（b）]的表面抗原顯著擴(kuò)增[61]。SRS基因擴(kuò)增的顯著差異和SRS基因?qū)Τ跏妓拗髅庖哒{(diào)節(jié)和寄生蟲毒力調(diào)節(jié)的影響差異仍然未知。在初次接觸后，寄生蟲利用活躍的滑行運(yùn)動和存在于分泌細(xì)胞器中持續(xù)表達(dá)的蛋白質(zhì)[即微線體（microneme, MIC）、棒狀體（rhoptry protein, ROP）和致密顆粒（GRA）]，通過移動連接進(jìn)入宿主細(xì)胞，形成PV [75-77]。與剛地弓形蟲中的機(jī)制不同，新孢子蟲中天冬氨酰蛋白酶的抑制劑胃蛋白酶抑制劑在組裝、運(yùn)輸微線體和棒狀蛋白到宿主細(xì)胞中起著重要作用，并且對新孢子蟲侵入有重要影響[77,78]。用兔抗N54進(jìn)行的免疫熒光研究鑒定了另一種新孢子蟲蛋白酶NcSUB1（以前稱為NC-p65）。NcSUB1位于新孢子蟲的微線體細(xì)胞器中，并參與宿主細(xì)胞的入侵機(jī)制[79]。運(yùn)動結(jié)合體的形成導(dǎo)致ROP蛋白注入PV中。在剛地弓形蟲中進(jìn)行的基于正向遺傳學(xué)的研究、數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus, QTL）分析和基于反向遺傳學(xué)的基因敲除研究，確定了ROP18/ROP5復(fù)合物是實驗室小鼠感染期間的主要毒力因子。ROP5蛋白與免疫相關(guān)的GTPase (immunity-related GTPase, IRG)結(jié)合以阻止其低聚和激活反應(yīng)，伴隨著ROP18介導(dǎo)的IRG磷酸化[80-87]。最近的研究表明，ROP18/ROP5復(fù)合物還包括另一種對低聚IRG具有高度親和度的棒狀激酶ROP17 [88]。有趣的是，對ROP18序列的全基因組的比較表明，ROP18在新孢子蟲中呈現(xiàn)假基因化，并且包含上游區(qū)域（upstream region, UPS）。上游區(qū)域存在于非毒性III型蟲株中，但不存在于毒性I型和中等毒性II型剛地弓形蟲蟲株中[61,89]。然而，在新孢子蟲（Nc1）中表達(dá)剛地弓形蟲I型RH毒株的ROP18增強(qiáng)了它們在小鼠中的毒性作用[90]。雖然ROP18在新孢子蟲中呈假基因化，但已充分證明干擾素γ（interferon-γ, IFN-γ）是抵抗新孢子蟲的主要細(xì)胞因子[91,92]。有趣的是，IFN-γ激活的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞不僅抑制了新孢子蟲的生長，而且還顯示了IRG（irga6、irgb6和iRGD）和鳥苷酸結(jié)合蛋白（mGBP1和mGBP2）對新孢子蟲的抵抗作用[93]。因此，綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，在實驗小鼠模型中，假基因化的ROP18和參與寄生蟲清除的IRG是導(dǎo)致新孢子蟲的非毒性表型的原因。除了IFN-γ以外，新孢子蟲還是toll樣受體（toll-like receptor, TLR3）依賴性I型（α/β）干擾素的有效激活劑[94]。在剛地弓形蟲的正向遺傳學(xué)研究中，研究人員還發(fā)現(xiàn)了一種非ROP2棒狀體蛋白ROP16。ROP16通過蟲株特定性方式運(yùn)輸?shù)剿拗骷?xì)胞核并磷酸化STAT3/STAT6，從而導(dǎo)致先天免疫信號的顯著激活并通過減弱IL-12信號抑制小鼠體內(nèi)的毒力[61,95,96]。與剛地弓形蟲相反，新孢子蟲ROP16僅磷酸化STAT3，而不磷酸化STAT6，從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞有凋亡趨勢[97]。棒狀蛋白質(zhì)組分析已經(jīng)在新孢子蟲中發(fā)現(xiàn)其他棒狀蛋白質(zhì)成分，包括NcROP1、NcROP5和NcROP30，它們與弓形蟲中的同源性很高。

類似地，在弓形蟲入侵期間，致密顆?？乖℅RA）被大量分泌出來，并在PV中組成性表達(dá)，以調(diào)節(jié)宿主信號通路。雖然一些GRA物質(zhì)已被鑒定為弓形蟲PV成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[98]，但其中與宿主細(xì)胞核相關(guān)的屈指可數(shù)：僅有GRA15 [99]、GRA16 [100]和GRA24 [101]。GRA15已被證明可激活NF-κB通路，并控制感染后剛地弓形蟲的IL-12分泌的誘導(dǎo)[99]。相反，GRA16參與細(xì)胞周期進(jìn)程和p53腫瘤抑制途徑[100]，而GRA24調(diào)節(jié)宿主p38α MAP激酶[101]。與剛地弓形蟲的情況相反，除了NcGRA6和NcGRA7（原名NcDG1 [102]和NcDG2 [103]），GRA在新孢子蟲中的特征不明顯。NcGRA7被分泌到PV中，并且位于PV基質(zhì)（PV matrix, PVM）中[76]。包括NcGRA1、NcGRA2、NcMAG1和NcNTPase在內(nèi)的其他GRA已被表征并在速殖子致密顆粒中表達(dá)，并位于PV基質(zhì)中[76,104]。雖然GRA15激活了剛地弓形蟲中的NF-κB通路[99]，但該基因在新孢子蟲中呈假基因化。

在實驗小鼠模型中，多種差異性和蟲株特異性分泌效應(yīng)因子對剛地弓形蟲與宿主的相互作用和毒力產(chǎn)生了影響。雖然新孢子蟲的特異蟲株差異還沒有得到很好的研究，但已經(jīng)有文獻(xiàn)記載了幾個不同免疫結(jié)果的實例。一個例子是，與無毒的Nc-SweB1分離株相比，對照株Nc-Liv被證明可在小鼠中引起嚴(yán)重的新孢子蟲病臨床癥狀，包括炎性浸潤和高度壞死病變[105]。另一種非毒性分離蟲株Nc-Nowra在實驗室小鼠中引起輕度至中度非化膿性腦炎，而Nc-Liv則引起嚴(yán)重非化膿性腦炎[106]。實驗室小鼠毒力分析還顯示NC1的毒性比NC3更強(qiáng)[107]?；谶@些觀察推測出，與剛地弓形蟲相似，毒力的差異是由于新孢子蟲蟲株特異性差異造成的。為了支持這一假設(shè)，研究人員進(jìn)行了比較差異凝膠電泳（difference gel electrophoresis, DIGE）和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）技術(shù)。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)組表達(dá)譜在強(qiáng)毒株和弱毒株之間存在顯著差異。此外，這些分析還發(fā)現(xiàn)了NTPase在強(qiáng)毒新孢子蟲蟲株中的表達(dá)不受調(diào)控[108]。最近的一項新孢子蟲免疫組學(xué)研究顯示，強(qiáng)毒蟲株（Nc-Liv,Nc-Spain1H）和弱毒蟲株（Nc-Spain7）之間存在蟲株特異性差異。結(jié)果還顯示出在強(qiáng)毒的蟲株中，有4種蛋白質(zhì)的表達(dá)始終較高：絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶2C、超氧化物歧化酶、GAP45和NcGRA1 [109]。與對剛地弓形蟲的研究同理，正向遺傳分析包括遺傳雜交的發(fā)展以及隨后的QTL分析或全基因組關(guān)聯(lián)測試，可能會鑒定出導(dǎo)致新孢子蟲致病機(jī)制中蟲株特異性差異的其他分泌決定因素。

11. 疫苗接種

牛新孢子蟲病造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失受到了全世界的廣泛關(guān)注。根據(jù)系統(tǒng)性的評估，全世界牛新孢子蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失估計為1.298×109USD?a-1，最高可達(dá)2.380×109USD?a-1[110]。這些損失的2/3來自于乳業(yè)（8.429×108USD?a-1），因為奶牛受到新孢子蟲感染而發(fā)生中位特異性流產(chǎn)的風(fēng)險（14.3%）比肉牛（9.1%）更高。此外，全球2/3的經(jīng)濟(jì)損失發(fā)生在北美洲（65.7%），其次是南美洲（18.5%）和大洋洲（10.6%），而歐洲三個國家（荷蘭、西班牙和英國）的損失估計僅為5.3%。因此，巴西、墨西哥和美國是接種新孢子蟲疫苗的主要目標(biāo)市場[110]。雖然牛新孢子蟲病疫苗的全球市場很大，但是目前還沒有預(yù)防會引發(fā)流產(chǎn)的新孢子蟲病的傳播的治療方法或疫苗。唯一獲得許可的犬新孢子蟲疫苗是Bovilis Neoguard（Intervet International B.V.，荷蘭）。它是由滅活的犬新孢子蟲速殖子（收獲時速殖子數(shù)為3×106個?mL-1）、10%的鹵素佐劑、5%的穩(wěn)定劑和5%磷酸鹽緩沖鹽水組成。不幸的是，在哥斯達(dá)黎加和新西蘭進(jìn)行的幾項后續(xù)研究表明，這種疫苗或者藥效低（20%），或者經(jīng)胎盤傳播增加導(dǎo)致胚胎早期死亡的風(fēng)險增加，最終這種疫苗退出市場[72,111]。近來，弓形蟲速殖子提取物疫苗與大豆卵磷脂/β-葡聚糖佐劑（sNcAg/AVEC）的可溶部分在孕牛中顯示出免疫原性并誘導(dǎo)出高IFN-γ反應(yīng)[112]。然而，由自然減毒或低毒力分離株（如Nc-Nowra [113]、Nc-Spain1H [114]和阿根廷分離株Nc-6 [115]）組成的新孢子蟲速殖子活疫苗可顯著提高犬新孢子蟲的抗體反應(yīng)，并大大降低流產(chǎn)率。但是，使用活疫苗存在一些固有的弊端，如活寄生蟲的大量保存問題以及免疫后病原性的逆轉(zhuǎn)風(fēng)險[116]。因此，滅活或亞單位疫苗是更有吸引力的選擇。遺憾的是，被低聚甘露糖微粒體（M3-NcGRA7）包裹的NcGRA7重組體（50～200 μg）[117]，以及細(xì)菌表達(dá)和純化的重組蛋白，包括rNcSAG1、rNcHSP20和rNcGRA7 [118]，都未能防止懷孕的母牛受到感染。因此，研發(fā)一種新的、更有效的疫苗，如新孢子蟲的減毒活株（包括Ca2+依賴性蛋白激酶2缺陷速殖子），對宿主長期免疫新孢子蟲病至關(guān)重要[119]。

12. 結(jié)論

頂復(fù)門犬新孢子蟲是導(dǎo)致牛流產(chǎn)、死胎或犬類神經(jīng)肌肉障礙的主要原因。牛新孢子蟲病對肉制品和乳品行業(yè)有巨大的經(jīng)濟(jì)影響，且目前尚無有效的防治方法。因此，研發(fā)出新藥物、疫苗和（或）工具來對抗新孢子蟲病極為迫切。為了研發(fā)出減輕新孢子蟲病侵害的新方法，有必要確定其種群遺傳結(jié)構(gòu)以預(yù)測病原體的進(jìn)化過程，還需要更好地了解宿主與病原體的相互作用。目前可用的遺傳標(biāo)記（基于RFLP和基于序列的標(biāo)記）還不能完全區(qū)分犬新孢子蟲分離株。近來，微衛(wèi)星標(biāo)記可以在新孢子蟲種群中鑒定出亞結(jié)構(gòu)。然而，利用微衛(wèi)星標(biāo)記確定的固定（FST）統(tǒng)計數(shù)據(jù)和Bayesian聚類算法被同源異型推翻。同源異型推斷出的種群結(jié)構(gòu)比可能存在的更為復(fù)雜。因此，對全世界范圍內(nèi)宿主的多種蟲株進(jìn)行全基因組測序是有必要的。這將擴(kuò)大現(xiàn)存遺傳標(biāo)記的適用范圍，并能生產(chǎn)出更好的模型，來確定通過無性繁殖或有性繁殖傳播的程度，以便制定出更明智的策略，降低傳播風(fēng)險并提高宿主對新孢子蟲急性和慢性感染的免疫保護(hù)。

Acknowledgements

The authors are supported by the Intramural Research Program of the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) at the National Institutes of Health.M.E.G. is a scholar of the Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR) Program for Integrated Microbial Biodiversity.

Compliance with ethics guidelines

Asis Khan, Jahangheer S. Shaik, Patricia Sikorski, Jitender P.Dubey, and Michael E. Grigg declare that they have no conf l ict of interest or fi nancial conf l icts to disclose.