注意缺陷多動障礙患兒的腸道菌群特征

張 珊 萬 林 孫于林 楊 光

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心兒內(nèi)科（北京 100853）

注意缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）是一種神經(jīng)精神類疾病，學(xué)齡期兒童多發(fā)，主要表現(xiàn)為注意力不集中伴或不伴有沖動和多動的癥狀[1]。ADHD發(fā)病機制可能與神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)相關(guān)，例如多巴胺、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）及去甲腎上腺素等激素水平的異常表達[2-4]。也有遺傳學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，多巴胺、去甲腎上腺素以及5-HT相關(guān)基因在ADHD患兒中存在異常表達[5-7]。另有研究表明，腸道菌群可能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，例如阿爾茨海默病、癲癇、孤獨癥等[8-9]。目前研究提示，在人體中存在微生物-腸-腦軸的雙向調(diào)節(jié)機制，腸道微生物的代謝產(chǎn)物，影響神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，從而影響腦部功能，同時神經(jīng)系統(tǒng)亦可反向調(diào)節(jié)腸道微生物的構(gòu)成，這種雙向調(diào)節(jié)是通過復(fù)雜的神經(jīng)-內(nèi)分泌通路所完成的[10]。而腸道菌群可以通過神經(jīng)遞質(zhì)、炎性因子及下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitaryadrenal axis，HPA）軸等來調(diào)節(jié)這一通路[11]。因此腸道菌群的異常構(gòu)成，可能會導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)異常分泌，從而促發(fā)神經(jīng)精神疾病的發(fā)生。本研究擬采用病例對照研究方法，分析ADHD 患兒與健康對照兒童的腸道菌群構(gòu)成差異，進一步探討ADHD 的發(fā)病機制，為ADHD治療探索潛在的新方法。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2019 年1 月至2019 年6 月在解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心兒科門診就診的ADHD 患兒作為研究對象。入組標準：①年齡6～12 歲；②首次確診為ADHD[12]；③近1 個月內(nèi)無呼吸道及消化道感染史；④近1個月內(nèi)無益生菌服用史；⑤無消化系統(tǒng)疾病或其他慢性病史；⑥BMI＜18；⑦無過敏性疾病，如過敏性鼻炎，哮喘等；⑧無ADHD治療藥物服用史。

同期征集6～12歲非ADHD無特殊疾病兒童作為對照。入組標準為：①年齡6～12 歲；②完成兒童情感障礙與精神分裂癥定式檢查問卷終生版（Kiddie-SADS-Present and Lifetime Version scale，K-SADS-PL）中的多動和注意力量表調(diào)查后，結(jié)果非ADHD 者；③～⑦同ADHD患兒。

本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準。所有入組研究對象及家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 ADHD組和對照組兒童均在入組后留取大便樣本，置于-80℃冰箱留存待測。

1.2.2 ADHD診斷與評估 對就診的疑似ADHD兒童，進行K-SADS-PL 量表中的多動和注意力量表調(diào)查，依據(jù)評分標準判斷是否符合ADHD臨床表現(xiàn)。而后由兒童神經(jīng)精神類疾病?？漆t(yī)師根據(jù)兒童癥狀表現(xiàn)及相應(yīng)檢查結(jié)果，參照美國精神病協(xié)會（American Psychiatric Association，APA）制定的《精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊》（The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，DSM-Ⅳ）中的ADHD診斷標準進行診斷。

1.2.3 糞便宏基因組檢測 稱取約20 mg糞便到研磨管中，并加入750 μL 緩沖液，使用勻漿儀對糞便樣本進行研磨，然后離心（10 000×g，離心1 分鐘）。取上清后按說明書進行糞便DNA 提取。采用鳥槍法宏基因組測序技術(shù)對標本中微生物進行全基因組測序。使用Bead-Beating 進行菌體破裂，HiPure Stool DNA kit 進行DNA 提取，Qubit 4.0 進行質(zhì)檢。隨后采用KAPA Hyper Prep Kit 試劑盒進行文庫構(gòu)建，在Illumina NovaSeq 平臺進行雙端測序，序列讀長為150 bp，即PE150。使用KneadData對所有宏基因組測序數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)預(yù)處理。KneadData采用Trimmomatic子模塊進行結(jié)構(gòu)引物序列、低質(zhì)量短讀框序列以及嵌合體序列等的篩除。隨后使用Bowtie2將測序序列與人類基因組序列進行比對以去除宿主基因，使用的參考基因序列為hg19版本。

1.2.4 菌群多樣性及菌屬分析 對完成預(yù)處理的測序序列，采用HUMAnN2 進行物種豐度的分析。先使用MetaPhlAn2將序列與事先建立好的核心基因比對，快速定位出菌群中所包含的物種；然后再將序列與定位出的物種的泛基因組進行比對，以明確微生物屬種。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用Fisher精確概率法檢驗。使用主成分分析與置換多因素方差分析對屬水平物種豐度進行檢驗。物種豐度分組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在屬和種水平上的豐度分析，另采用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）效應(yīng)值LEfSe方法來確定多動癥兒童特有的腸道微生物特征，LDA＞2為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時通過計算基因豐度的熵值確定Shannon、Simpson及Chao1指數(shù)以分析菌群α多樣性。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

共納入ADHD 患兒17 例，其中男14 例、女3例，中位年齡8（7～9.5）歲；健康兒童17 例，其中男13 例、女4 例，中位年齡8（7～10）歲。兩組間性別（P=1.000）及年齡（Z=0.25，P=0.799）的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 菌群差異性分析

ADHD 患兒與健康兒童腸道微生物α 多樣性Shannon 指數(shù)分別為9.79（9.27～10.01）和9.55（9.29～9.61），Simpson指數(shù)分別為0.92（0.88～0.95）和0.89（0.88～0.91），Chao1指數(shù)分別為62.0（55.0～72.0）和56.0（53.0～72.0），兩組間各指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=1.22、1.19、0.24、P均＞0.05）。見圖1。

在屬水平上，對ADHD患兒與健康兒童微生物物種相對豐度進行主成分分析與置換多因素方差分析檢驗后顯示，無法將其有效區(qū)分，兩組間無明顯差異（P=0.223）。見圖2。

ADHD 組糞腸桿菌屬Faecalibacterium及韋榮球菌屬Veillonellaceae豐度較低（Z=3.15、P=0.002，Z=2.11、P=0.035），而氣味桿菌屬Odoribacter豐度較高（Z=2.11、P=0.035）。行LEfSe檢驗提示，除上述差異外，可見腸球菌屬Enterococcus在ADHD患兒中顯著增高（LDA＞2）。見圖3。

圖1 菌群α 多樣性分析

圖2 屬水平多動癥患者與健康人的主成分分析與置換多因素分析

圖3 菌屬及種水平ADHD 患兒與健康兒童差異圖

種水平的LDA 結(jié)果顯示，ADHD 患兒的臭味菌科（Odoribacteraceae）和腸桿菌科（Enterocaccaceae）顯著增加，而瘤胃菌科（Ruminococcaceae）顯著減少（LDA＞2）。見圖3。在種水平上，行秩和檢驗顯示，ADHD 患兒的普氏棲糞桿菌Faecalibacterium prausnitzii、毛螺科菌Lachnospiraceae bacterium、小韋榮球菌Veillonella parvula以及活潑瘤胃球菌Ruminococcus gnavus豐度顯著降低（Z=2.91、P=0.004，Z=2.44、P=0.015，Z=2.14、P=0.032，Z=2.35、P=0.019），糞擬桿菌Bacteroides caccae、內(nèi)臟擬桿菌Odoribacter splanchnicus以及木假單胞菌Paraprevotella xylaniphila豐度顯著增高（Z=2.41、P=0.016，Z=2.12、P=0.029，Z=2.12、P=0.034）。

3 討論

腸道作為哺乳動物體內(nèi)最大的生態(tài)系統(tǒng)，有超過100 萬億個微生物，可影響宿主的生理功能[13]。微生物-腸-腦軸這一理論的提出表明，腸道菌群與大腦存在雙向調(diào)節(jié)機制，具有復(fù)雜的神經(jīng)-內(nèi)分泌通路。既往報道，患有ADHD 的兒童可能存在神經(jīng)遞質(zhì)異常，而腸道菌群有可能通過神經(jīng)內(nèi)分泌通路調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的水平[14]。

本研究中，ADHD患兒腸道菌群與健康兒童相比存在明顯差異。與以往文獻報道[15]相同，本研究中ADHD患兒與健康兒童的腸道菌群α多樣性一致，在具體菌屬等水平上可見糞腸桿菌屬明顯減低。但與以往報道不同的是，本研究中ADHD患兒的韋榮球菌屬明顯減低，而腸球菌屬、氣味桿菌屬明顯增高；在菌種水平上還發(fā)現(xiàn)ADHD患兒的普氏棲糞桿菌、毛螺科菌以及活潑瘤胃球菌顯著較少，糞擬桿菌、內(nèi)臟擬桿菌、木假單胞菌以及小韋榮球菌則顯著增多。

ADHD作為一種神經(jīng)精神類疾病，其發(fā)病機制目前仍未完全探明。既往研究指出，神經(jīng)遞質(zhì)水平的異常表達參與了發(fā)病過程[16]?；诖朔N理論，臨床中常用的治療藥物主要為中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，如鹽酸哌甲酯等，其作用機制可能為通過抑制突觸間隙對多巴胺的再攝取，從而提高多巴胺水平，對癥狀進行控制，但臨床治療效果不一[17]。

既往研究表明，腸道菌群通過微生物-腸-腦機制，參與了神經(jīng)類疾病的致病過程，其中包括阿爾茨海默病、癲癇、孤獨癥譜系障礙及抽動障礙等[9,16,18]。研究表明，早期腸道菌群的形成可影響大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，造成其成熟后的焦慮行為等心理健康問題，如給予孕期母鼠低劑量抗生素處理后，可導(dǎo)致其腸道菌群失調(diào)，進而引起其后代的生理行為改變[18-20]。將精神分裂患兒的腸道菌群移植到無菌小鼠體內(nèi)后，可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)相應(yīng)的精神癥狀，而此種效應(yīng)的產(chǎn)生與菌群調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酰胺-谷氨酸-GABA通路相關(guān)[21]。將帕金森患者的腸道菌群移植到無菌帕金森模型小鼠腸道內(nèi)后，小鼠的運動癥狀明顯加重，而給予抗生素處理后，這一癥狀得到糾正[22]。

在本研究中，ADHD患兒存在糞腸桿菌屬低表達。而在以往的動物和人類研究中可以觀察到，糞腸桿菌屬低表達可能導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，例如哮喘、濕疹和過敏性鼻炎等[23]，同時，具有過敏體質(zhì)的兒童患ADHD 的風險增加30%～50%[24]。由此可推測，這一菌屬的低表達可能導(dǎo)致過敏發(fā)生，同時通過腦-腸-軸影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，進而導(dǎo)致ADHD。另有研究表明，高脂、高蛋白、高糖飲食更容易引發(fā)ADHD，而這種飲食可導(dǎo)致糞腸桿菌屬低表達[25]，兩者之間存在著相關(guān)性。糞腸桿菌屬具有抗炎作用，其表達水平降低，可能導(dǎo)致炎性因子表達增加[26-27]，而ADHD患兒炎性因子水平有明顯增高[28]，炎性因子可通過血腦屏障從而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及腦部功能[29]。因此，可推測糞腸桿菌屬失調(diào)而引起的炎癥因子的變化，可能也參與了ADHD的發(fā)病。

同時，本研究中ADHD 患兒的腸球菌屬明顯增高，而已有報道腸球菌屬與神經(jīng)遞質(zhì)緊密相關(guān)。研究表明，腸球菌屬與血清素轉(zhuǎn)運體相關(guān)，血清素轉(zhuǎn)運體缺乏的小鼠可見腸球菌屬明顯增高[30]，而血清素轉(zhuǎn)運體缺乏通過降低5-HT 水平，而導(dǎo)致ADHD 發(fā)病[31]。近期有研究指出，腸球菌屬可以導(dǎo)致帕金森的一線治療藥物左旋多巴在外周過多地轉(zhuǎn)換為多巴胺，但由于血腦屏障，導(dǎo)致外周多巴胺無法進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)；同時腸球菌屬的異常增高，還導(dǎo)致酪氨酸脫羧酶的過度激活，使酪氨酸及苯丙氨酸的脫羧化反應(yīng)加劇，無法有效進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為多巴胺前體左旋多巴。以上兩條途徑均可使中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多巴胺濃度減低，從而導(dǎo)致帕金森癥狀加劇[32]。而既往大量研究均表明，ADHD發(fā)病與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺減少相關(guān)[3,33-34]。因此，本研究所呈現(xiàn)的腸球菌屬增高可能通過以上作用機制，導(dǎo)致顱內(nèi)多巴胺減少而誘發(fā)ADHD。另外，本研究中ADHD 患兒的氣味桿菌屬明顯增高。氣味桿菌屬Odoribacter也與神經(jīng)精神疾病密切相關(guān)。兒童急性發(fā)作神經(jīng)精神綜合征（pediatric acute onset neuropsychiatric syndrome，PANS）與鏈球菌感染相關(guān)性小兒自身免疫性神經(jīng)精神障礙（pediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infectoins，PADANS）患兒與健康兒童相比，腸道菌群中的氣味桿菌屬顯著增高；經(jīng)相關(guān)軟件預(yù)測后，發(fā)現(xiàn)PANS及PANDAS患兒的多巴胺代謝通路明顯下調(diào)，同時氣味桿菌屬相對豐度的比例高低與抗鏈球菌溶血素O效價呈明顯正相關(guān)[35]，提示氣味桿菌屬可能導(dǎo)致多巴胺代謝通路的異常從而導(dǎo)致ADHD發(fā)病。

本研究嚴格設(shè)置了ADHD 患兒的入組及排除標準，同時納入健康兒童作為對照，并對納入的健康兒童進行了ADHD量表評估，以排除潛在的ADHD患兒。但本研究存在樣本量小，未考慮飲食差異等問題，將在下一步研究中予以完善。

綜上可推測，腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，可能導(dǎo)致微生物-腸-腦軸的功能失調(diào)，從而使神經(jīng)內(nèi)分泌通路失衡，進而導(dǎo)致ADHD的發(fā)病。