晚期早產(chǎn)兒喂養(yǎng)不耐受腸道菌群研究

任建東 李 軍 嚴(yán) 潔 馬 巖 金 華 顧 嵐 高 麗 顧震宇

蘇州市第九人民醫(yī)院新生兒科（江蘇蘇州 215200）

隨著圍生醫(yī)學(xué)及新生兒重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)的發(fā)展，早產(chǎn)兒的就診率及存活率逐步提高，而早產(chǎn)兒各種相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率也隨之升高，其中喂養(yǎng)不耐受是早產(chǎn)兒治療過程中普遍存在的問題之一，可影響早產(chǎn)兒的近期及遠(yuǎn)期預(yù)后。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月至12月蘇州市第九人民醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房收治的胎齡34周以上的早產(chǎn)兒為研究對象。研究對象入選標(biāo)準(zhǔn)：①出生24小時內(nèi)；②出生胎齡34～36+6周；③母親無產(chǎn)前感染及胎膜早破；④入院后以早產(chǎn)兒配方奶喂養(yǎng)；④住院期間未使用過抗生素；⑤剔除合并嚴(yán)重并發(fā)癥者，如罹患感染、循環(huán)呼吸系統(tǒng)疾病、出生窒息、先天性消化道畸形。結(jié)合《實用新生兒學(xué)》第4版中的喂養(yǎng)不耐受診斷及Dutta等[1]發(fā)布的《喂養(yǎng)指南》，符合以下任一種情況者為喂養(yǎng)不耐受（不耐受組）：①喂奶后發(fā)生反流或頻繁嘔吐（≥3次/d）；②奶量減少或＞3天奶量不增；③胃內(nèi)含有咖啡色樣物；④大便隱血陽性；⑤鼻飼喂養(yǎng)時，潴留量＞5 mL/kg或大于上次喂養(yǎng)量的1/2。喂養(yǎng)不耐受患兒經(jīng)過干預(yù)后喂養(yǎng)不耐受癥狀基本消失者為緩解組。無喂養(yǎng)不耐受發(fā)生者為對照組。

研究經(jīng)蘇州市第九人民醫(yī)院倫理和安全委員會批準(zhǔn)，取得受試對象家長的知情同意并簽署知情同意書。研究過程遵循醫(yī)學(xué)倫理委員會所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 糞便標(biāo)本采集、處理及菌群檢測 分別留取喂養(yǎng)不耐受早產(chǎn)兒喂養(yǎng)不耐受時、緩解后，以及同期對照組的糞便標(biāo)本。取樣時使用無菌棉拭子，插入研究對象糞便中部內(nèi)側(cè)取樣，將足量糞便樣本轉(zhuǎn)移到采集管保存液中，2小時內(nèi)將采集管置入-20 ℃冰箱冷凍保存，并在48小時內(nèi)放入-76 ℃超低溫冰箱保存。樣本交由蘇州協(xié)云基因科技有限公司進(jìn)行檢測，檢測流程為核酸提取、DNA質(zhì)檢、文庫構(gòu)建、文庫質(zhì)檢、測序和數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 組間菌落比較 從各樣本在門、屬層級上的相對豐度分析表出發(fā)，獲得各分組在門、屬層級上的相對豐度表，并分析各分組在門、屬水平上的群落結(jié)構(gòu)及差異。

1.2.3 Alpha多樣性 可反映物種豐富度和均勻度以及測序深度。使用的Alpha多樣性指數(shù)有：Observed_otus、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)。Observed_otus：樣本中直觀統(tǒng)計的OTU數(shù)，數(shù)值越高表明樣本物種豐富度越高。Chao1指數(shù)：樣本中所含物種數(shù)目的指數(shù)，其值越大樣本中物種總數(shù)越多。Shannon指數(shù)：最常用來估算樣本中微生物多樣性及均勻度的指數(shù)，其值越大，說明群落物種豐度以及均勻度都很高。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

納入喂養(yǎng)不耐受早產(chǎn)兒30例，分別在喂養(yǎng)不耐受時及緩解時收集糞便樣本；對照組30例。不耐受組與對照組的性別、出生胎齡、出生體質(zhì)量、Apgar 評分、分娩方式的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 門水平糞便菌群組成及差異分析

不耐受組、緩解組和對照組糞便樣本均以厚壁菌門（Firmicute）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）為主，在各組樣本中所占比例均達(dá)99%以上；但三組之間擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，不耐受組與緩解組的擬桿菌門和放線菌門的相對豐度均低于對照組，不耐受組變形菌門的相對豐度高于對照組及緩解組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 屬水平糞便菌群組成及差異分析

三組糞便樣本均以腸球菌屬（Enterococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、擬桿菌屬、梭菌屬（Clostridium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）及雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）為主，在各組樣本中所占比例均達(dá)99%以上，三組之間各菌屬的相對豐度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，不耐受組腸球菌屬和擬桿菌屬的相對豐度低于對照組與緩解組；不耐受組鏈球菌屬和葡萄球菌屬的相對豐度高于對照組與緩解組；不耐受組與對照組的梭菌屬的相對豐度低于緩解組；不耐受組與緩解組的雙歧桿菌屬對豐度低于對照組；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表1 兩組患兒一般情況比較(±s)

表1 兩組患兒一般情況比較(±s)

2.4 三組糞便菌群多樣性比較

三組間Observed_otus 數(shù)值、Chao 1 指數(shù)和Shannon指數(shù)的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，不耐受組的Observed_otus 數(shù)值、Chao1指數(shù)和Shannon 指數(shù)均低于對照組及緩解組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

3 討論

由于早產(chǎn)兒孕周小，胃腸道功能尚未發(fā)育成熟，胃腸道運(yùn)動功能及神經(jīng)內(nèi)分泌功能發(fā)育不成熟，腸道菌群建立不足，腸道屏障功能不完善，腸道免疫功能差，易致早產(chǎn)兒發(fā)生喂養(yǎng)不耐受[2]。而喂養(yǎng)不耐受的發(fā)生可致早產(chǎn)兒發(fā)生宮外發(fā)育遲緩，從而延長住院時間，降低早產(chǎn)兒存活率，甚至影響智力發(fā)育和遠(yuǎn)期預(yù)后[3]。越來越多的研究表明，腸道菌群結(jié)構(gòu)建立的不完善是早產(chǎn)兒發(fā)生不耐受的原因之一。

腸道中定植的細(xì)菌具有數(shù)量巨大、多樣化、復(fù)雜性和動態(tài)性的特點(diǎn)，構(gòu)成了人體的腸道微生物菌群[4]，在維持人體健康中發(fā)揮著重要的作用。腸道菌群定植是一個復(fù)雜的過程。最近研究發(fā)現(xiàn)，對臍帶、胎盤、羊水、胎糞及胎膜等進(jìn)行16 S rDNA 基因測序檢測，均可檢出微生物DNA，提示胎兒在母體妊娠階段可能已形成自有微生態(tài)[5-6]。新生兒腸道菌群定植過程中，開始定植的細(xì)菌為需氧菌與兼性厭氧菌，這些細(xì)菌消耗腸道內(nèi)氧氣，為厭氧菌創(chuàng)造缺氧環(huán)境[7]。生命早期腸道菌群的建立可受到諸多內(nèi)、外界因素的影響，如遺傳因素、宮內(nèi)菌群暴露、分娩方式、喂養(yǎng)方式、胎齡、抗生素的使用、生活環(huán)境等[8-9]。而早產(chǎn)兒由于胃腸道不成熟，出生后常規(guī)氧療使腸道由宮內(nèi)低氧環(huán)境轉(zhuǎn)向富氧環(huán)境，處于新生兒重癥監(jiān)護(hù)室相對無菌的環(huán)境中，缺乏母乳喂養(yǎng)，抗生素的應(yīng)用及醫(yī)療操作等[4]，以致早產(chǎn)兒腸道細(xì)菌定植模式往往不同于足月兒，不僅是腸道菌群的定植延遲，而且還存在菌種類別及多樣性降低，從而不能形成完整的腸道黏膜的微生態(tài)屏障[10]。

表2 門水平三組糞便菌群相對豐度比較(±s)

表2 門水平三組糞便菌群相對豐度比較(±s)

注：1)與對照組比較，P＜0.05；2)與緩解組比較，P＜0.05

表3 屬水平三組糞便菌群相對豐度比較(±s)

表3 屬水平三組糞便菌群相對豐度比較(±s)

注：1)與對照組比較，P＜0.05；2)與緩解組比較，P＜0.05

表4 三組糞便菌群多樣性比較(±s)

表4 三組糞便菌群多樣性比較(±s)

注：1)與對照組比較，P＜0.05；2)與緩解組比較，P＜0.05

本研究采取Illumina 高通量測序技術(shù)，高通量測序技術(shù)是基于16S rDNA的微生物群落分析中的要點(diǎn)，能產(chǎn)生測序覆蓋深度極其深的測序數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)來源的微生物物種進(jìn)行分析，能估計出微生物群落的微生物種的組成。因此，Illumina 高通量測序技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)低豐度細(xì)菌或未知的細(xì)菌，具有測序快、準(zhǔn)確度高、通量高的特點(diǎn)，能夠全面分析腸道菌群的多樣性、豐度和物種構(gòu)成[11]。

本研究結(jié)果顯示，三組糞便樣本的主要菌群種類相同，但是在門水平及屬水平上三組糞便標(biāo)本的各菌群所占比例均存在差異。門水平均以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、藍(lán)藻菌門為主。三組糞便菌群的厚壁菌門相對豐度比較無顯著差異，厚壁菌門為兼性厭氧菌，可利用新生兒腸道豐富的氧氣，成為優(yōu)勢菌，但當(dāng)氧化還原電位降低時，第2 周就失去了這個優(yōu)勢。而在三組糞便標(biāo)本中，不耐受組變形菌門的相對豐度顯著高于對照組及緩解組，對照組擬桿菌門、放線菌門的相對豐度顯著高于不耐受組及緩解組。擬桿菌在健康人的糞便中是絕對優(yōu)勢菌，其在幫助宿主分解多糖提高營養(yǎng)利用率，加快腸黏膜血管形成及免疫系統(tǒng)發(fā)育，維持腸道微生態(tài)平衡等方面起重要作用[12]。有研究表明炎癥性腸病患者腸道微生物中擬桿菌門比例下降，而變形菌門比例升高[13]。屬水平三組糞便樣本菌群均以腸球菌屬、鏈球菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬、葡萄球菌屬及雙歧桿菌屬為主，不耐受組的腸球菌及擬桿菌屬的相對豐度顯著低于對照組及緩解組，緩解組梭菌屬的相對豐度則高于不耐受組及對照組，而對照組雙歧桿菌屬的相對豐度高于不耐受組及緩解組，不耐受組鏈球菌屬及葡萄球菌屬的相對豐度高于對照組及緩解組。有研究表明腸球菌屬中常見的糞腸球菌，可以通過自身的代謝產(chǎn)物和其他腸道菌群一起調(diào)整機(jī)體微生態(tài)的平衡，減輕宿主的炎癥反應(yīng)，對腸道起到保護(hù)性作用[14]。擬桿菌屬、梭菌屬等，它們直接影響機(jī)體的定植抗力，對宿主的健康發(fā)揮重要的作用。雙歧桿菌是人體腸道中最重要的益生菌之一，它對維持腸道菌群的平衡、提高機(jī)體免疫力和抗感染力以及控制內(nèi)毒素等都有著非常重要的作用，其數(shù)量的增加可以修復(fù)損傷腸壁，降低受損腸壁的通透性，是人體健康的主要守護(hù)菌群[15]。本研究中不耐受組的腸球菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬及雙歧桿菌屬的相對豐度均較低，而鏈球菌屬及葡萄球菌屬的相對豐度偏高，它們具有致病性或潛在致病性，可引起細(xì)菌移位并導(dǎo)致內(nèi)源性感染疾病的發(fā)生。

國內(nèi)外研究顯示，喂養(yǎng)不耐受的新生兒腸道菌群多樣性低于健康新生兒，而在喂養(yǎng)不耐受緩解后其腸道菌群多樣性基本與健康兒無異[16]，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示反映物種豐富度的Observed_otus、Chao 指數(shù)及反映微生物多樣性及均勻度的Shannon指數(shù)，不耐受組均顯著低于對照組及緩解組，而對照組及緩解組之間無顯著差異。

綜上所述，各菌群在三組糞便樣本中相對豐度的差異與喂養(yǎng)不耐受的發(fā)生有密切聯(lián)系，且喂養(yǎng)不耐受的發(fā)生與腸道菌群多樣性的降低密切相關(guān)，并隨著喂養(yǎng)不耐受癥狀的緩解，腸道菌群的多樣性亦在逐漸恢復(fù)。腸道內(nèi)有益菌的減少，致病菌或條件致病菌的增加、侵入致使體內(nèi)微生態(tài)的失衡，從而使患兒腸道不能形成完整的腸道黏膜微生態(tài)屏障而影響機(jī)體胃腸功能的發(fā)展及成熟，成為導(dǎo)致早產(chǎn)兒發(fā)生喂養(yǎng)不耐受的誘因之一，但是具體機(jī)制及關(guān)系還需進(jìn)一步研究。我們在臨床工作中需盡量減少不利于早產(chǎn)兒腸道菌群建立的因素，并且采取有效措施及早幫助早產(chǎn)兒建立正常的腸道菌群，從而減少喂養(yǎng)不耐受的發(fā)生，提高早產(chǎn)兒的生存質(zhì)量。我們將進(jìn)一步研究早產(chǎn)兒口服益生菌后喂養(yǎng)不耐受發(fā)生情況及其腸道菌群變化。